海南汉族乙型肝炎病毒基因型与BCP区和前 C区基因突变的关系

曾俊涛，陈 静，曾仕平，钟良宝

(海南医学院附属医院，海口 570102)

研究发现，不同基因型乙型肝炎病毒(HBV)与感染后临床疾病谱有一定的相关性。迄今为止，海南汉族人群 HBV基因型与前 C区和 BCP区基因突变的关系尚未见报道。为此，本研究通过对慢性乙型肝炎(CHB)患者 HBV基因型和基因序列的检测，探讨海南汉族 HBV基因型与前 C区 G1896A和BCP区 A1762T/G1764A基因突变之间的相互关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2005年 2月 ～2006年 10月海南医学院附属医院门诊和住院 CHB患者 83例，男 48例、女 35例，年龄 21～58(37.55±9.68)岁。患者诊断均符合 2005年中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会联合制定的诊断标准，并排除了其他嗜肝病毒和艾滋病病毒的感染。患者血清 HBV DNA检测均为阳性，入组前均未接受抗病毒治疗。

1.2 HBV基因型检测 采空腹静脉血，分离血清，冻存于 -20℃待检。按照HBV基因分型试剂盒(广州华银生物有限公司)说明书的要求，RT-PCR方法检测患者的 HBV基因型。从 50μl血清中提取 HBV DNA，取 B、C、D型反应液各 23 μl，分别加入 1 U Taq酶和 2μl模板来配制反应体系。PCR反应条件:94℃ 60 s，94℃5 s，60℃ 30 s，40个循环。荧光素设定为 6-羧基荧光素。在反应程序的第 2步 60℃末读取荧光值，样本在哪一型反应液中有扩增即为该型;如果在多型反应液中都有扩增，判为混合感染[1，2]。

1.3 HBV前 C区和 BCP区基因突变的检测 HBV DNA的提取采用北京 Tiangen生物有限公司 DNA提取试剂盒，严格按照说明书的操作要求自200μl血清中提取 HBV DNA作为 PCR模板。PCR扩增上游引物为 5'-CCCAAGGTCTTACATAAGAGG-3'，下游引物为5'-GGTGGCCAGATTCATCAACT-3，扩增片段的长度为470 bp，包括 C启动区、前 C区和部分 X基因。 PCR的反应条件:首先 94℃预变性 120 s;然后 94℃变性60 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，30个循环;72 ℃延伸 600 s。取 5μl PCR产物，经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应效果。PCR产物经纯化后，送由中国国家人类基因组南方研究中心检测。

1.4 统计学方法 采用 SPSS12.0统计软件，计量资料以±s表示，不同组之间计量资料比较采用t检验。HBV基因型、BCP区和前 C区基因突变在不同组之间分布比较采用 χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV C区基因 PCR产物电泳结果 采用 PCR扩增 HBV C基因核苷酸(nt1643-nt2112)。预期片段长度为 470 bp，包括 C启动子、前 C区及部分 X基因。扩增片段阳性者可在 470 bp处见到荧光条带。

2.2 HBV BCP区 A1762T/G1764A、HBV前 C区G1896A突变基因测序结果 见图1、图 2。

图1 BCP区 A1762T/G1764A基因突变

图2 前 C区 1896G→A突变基因

2.3 不同基因型与BCP区A1762T/G1764A和前C区 G1896A突变的关系 34例基因型 C BCP区A1762T/G1764A突变率(58.82%)显著高于基因型B(10.53%)(χ2=18.36，P＜0.05)。基因型 C G1896A突变率为 29.41%，基因型 B G1896A突变率为 47.37%，两者之间比较无统计学差异(χ2=2.43，P＞0.05)。见表1。

表1 83例汉族CHB患者基因型与 BCP区A 1762T/G1764A和前 C区G 1896A突变的关系[例(%)]

3 讨论

研究显示，不同基因型 HBV在致病性方面存在一定差异[3]。有文献报道[4]，基因型 C与较高的HBV DNA水平有关。Lindh等[5]研究也显示，与基因型 B比较，基因型 C更易引起严重的肝脏疾病，且与肝脏组织炎症坏死、纤维化关系密切。

BCP区有 3个 AT富集区，分别位于 nt1752-1755(ATTA)，nt1758-1762(TTAAA)，nt1789-1795(ATAAATT)。BCP区变异最常见在 1762位核苷酸A→T和 1764位核苷酸 G→A，称为双位点突变。本研究显示，基因型 C BCP区 A1762T/G1764A突变率显著高于基因型 B。我们推测 BCP区 A1762T/G1764A突变可能是影响基因型 C和基因型 B HBV致病力差异的原因之一。BCP区 A1762T/G1764A双突变可能通过以下机理影响 HBV致病性:①突变使 HBV的转录和包装增加，加强病毒复制;②突变增强 HBV DNA与肝细胞 DNA的整合;③BCP区A1762T/G1764A双突变可减少 HBeAg的表达，引发针对 HBcAg的抗体反应，加剧细胞坏死和损伤;④BCP区 A1762T/G1764A突变使 X基因编码区密码子发生改变，导致 X蛋白结构异常，从而影响 X蛋白反式激活，导致肝脏组织损害加剧[6]。

HBV前 C区 mRNA翻译产生一个 25 kD蛋白，其被信号肽序列引导至内质网，形成 HBeAg的前体蛋白。在目前发现的前 C区基因突变位点中，第1896位核苷酸突变最为常见。G1896A的变异可以导致第 28位密码由色氨酸 TGG突变成终止密码TAG，终止或减少 HBeAg合成[7，8]。本研究显示，基因型 C前 C区 G1896A突变率与基因型 B前 C区G1896A突变率比较无差异，提示前 C区 G1896A可能与不同基因型 HBV致病力的差异无关。

综上所述，不同基因型 HBV致病能力可能与病毒基因组 BCP区 A1762T/G1764A突变率的不同有关，而与前 C区 G1896A突变无关。

[1]Hen JK，Hou JL，Zhou R，et al.Comparison of three genotyping methods for hepatitis B virus[J].Chin J Hepatol，2006，14(8):620-622.

[2]Shen JK，Zhou R，Li WF，et al.Distribution of hepatitis B virus genotypes in Lanzhou region assayed by the real time fluorimetry polymerase chain reaction and its clinical investigation[J].Zhonghua Jianyan Yixue Zazhi，2005，28(9):925-927.

[3]Marcellin P，Chang TT，Lim SG，et al.Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis B eantigen-positive chronic hepatitis B[J].N Engl J Med，2003，348(9):808-816.

[4]Kao JH.Hepatitis B virus genotypes and hepatocellular careinoma in Taiwan[J].Intervirology，2003，46(6):400-407.

[5]Lindh M，Gonzales JE，Norkrand G，et al.Genotyping of hepatitis B virusby rest riction pattern analysisof a Pre-S amplicon[J].Virol Methods，1998，72(2):163-174.

[6]Parekh S，Zoulim F，Ahn SH，et al.Genomereplication，virion secretion and e antigen expression of naturally occurring hepatitis B virus core promoter mutants[J].Jvirol，2003，77(12):6601-6612.

[7]Gandhe SS，Chadha MS，Walinbe AM，et al.Hepatitis B virus:prevalenceof precore/core promoter mutants in different clinical categories of Indian patients[J].JViral Hepat，2003，10(5):367-382.

[8]Li Z，Dou X，Liu P.Pre-core mutation of HBV among 26 families with history of chronic HBV infection in Shenyang[J].Zhonghua Shiyan He Linchuang Bingduxue Zazhi，2002，16(3):239-241.