非小细胞肺癌E19-Del、L858R突变临床特征分析

房延凤 马李杰 刘雁声 南岩东 苏 蔚 金发光 张 涛 张红军

肺癌是全球发病率和死亡率最高的肿瘤[1-2]，亚洲人肺腺癌约占肺癌50%[3-4]，且很多肺癌诊断时已属于晚期，目前其5年生存率仍很低，相关报道仅约13%[5]。以EGFR酪氨酸酶抑制剂为代表的分子靶向治疗显著延长了晚期非小细胞肺癌患者生存期[6]，而EGFR基因突变检测为非小细胞肺癌是否可以行靶向治疗及靶向治疗药物选择提供了重要依据[7]。大量研究表明，EGFR基因突变主要存在于18-21外显子上[8]，TKI治疗最有效的敏感突变为19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变，既往研究报道，19外显子的缺失突变约占EGFR突变的45%，L858R点突变占EGFR突变的40%～45%[9]。本文回顾性分析我科498例非小细胞肺癌患者通过ARMS法检测其EGFR基因上19、21外显子的2个突变位点，总结分析其突变临床特征，为临床治疗提供参考。

对象与方法

一、研究对象

选取2012年7月至2018年7月空军军医大学第二附属医院呼吸科确诊的非小细胞肺癌498例，腺癌407例，鳞癌82例，腺鳞癌4例，大细胞神经内分泌癌3例，肉瘤样癌2例。其中男性305例，女性193例，最小年龄32岁，最大年龄82岁，中位年龄61.13岁。

二、设备与方法

1. 主要仪器和试剂: Roche 480Ⅱ荧光定量PCR仪，Invitrogen Qubit 2.0核酸蛋白定量仪，Thermo PICO17台式高速离心机，水浴锅等；DNesasy® Blood & Tissue Kit(QIAGEN)，QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)，QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)，EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(苏州为真)等。

2. 核酸纯化： ①胸水和新鲜组织：所取样本必须明确病理及肿瘤细胞含量。胸水50 ml低速离心5 min弃上清，沉底物-20 ℃保存或进入下一步纯化；新鲜组织需芝麻粒大小1～2块。处理好样本之后，按照DNesasy® Blood & Tissue Kit(QIAGEN)流程纯化核酸；②外周血：采集患者化疗前或化疗后4周外周血8～10 ml(EDTA抗凝)，按照QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)流程纯化ctDNA；③石蜡组织：取石蜡组织切片3～5 μm厚，5～10片，按照QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)流程纯化核酸。

为保证检测结果准确性，纯化获得的DNA，在检测前需进行含量测定。要求：DNA纯度检测OD260/280比值在1.8～2.0，DNA浓度不低于10 ng/μl。纯化好的DNA -20 ℃保存或进入下一步EGFR基因突变检测。

3. EGFR基因突变检测： 检测使用苏州为真公司EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)。试剂盒基于实时荧光定量PCR平台，利用突变特异扩增PRCR和溶解曲线分析结合技术检测基因特定突变。该技术以偏向扩增技术(amplification refractory mutation system, ARMS)为主，融合了溶解曲线(Melting Curve)和野生型DNA阻滞序列野生型阻滞探针两种技术，荧光PCR检测体系中所使用指示剂为Evagreen荧光染料。将DNA调整浓度至5 ng/ml，按照EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明进行试剂混合和上机操作。

4. 结果判读： ①阳性质控(STD)有扩增曲线且Ct值<40，且峰形正常；②Ct值要求：每个位点的ΔCt值临界值及样本内控要求见试剂盒使用说明；③阳性样本：有典型S型扩增曲线，且某个位点的ΔCt值在切值范围内，同时该位点的溶解峰形的Tm值与STD该位点溶解峰形的Tm值的差值绝对值小于或等于1。

三、统计学方法

数据用SPSS19.0软件包处理，计数资料用例数(n)和构成比(%)表示，组间比较应用卡方检验或Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、入选患者E19-Del、L858R总体突变情况

498例非小细胞肺癌中E19-Del、L858R共突变108例，突变率21.687%，其中男性共突变49例，突变率为16.066%；女性共突变59例，突变率30.570%。

二、E19-Del突变情况与临床特征

498例非小细胞肺癌中E19-Del突变63例(12.651%)，其中小于50岁突变率21.127%，大于等于50岁而小于70岁突变率10.458%，大于等于70岁突变率13.223%，三组比较有统计学差异。腺癌E19-Del突变率15.233%，其他类型突变率1.099%，两组比较有统计学差异。Ⅳ期患者E19-Del突变率14.653%，Ⅲ期患者E19-Del突变率6.329%，Ⅰ期和Ⅱ期患者E19-Del突变率3.333%，三组比较有统计学差异，Ⅳ期和Ⅲ期突变率比较亦有统计学差异。E19-Del突变特征还表现在：均是未并发其它肿瘤，女性突变率高于男性，合并骨转移、脑转移的突变率高于无转移的，胸膜、淋巴结未转移组突变率高于有转移组，无糖尿病、高血压组突变率高于合并糖尿病、高血压，左肺肿瘤突变率略高于右肺肿瘤，但均无统计学差异，见表1。

三、E19-Del突变与吸烟量相关性比较

不吸烟组E19-Del突变率14.286%，吸烟每天大于20支突变率5.333%，两者比较有统计学差异；吸烟每天小于或等于20支突变率13.415%，与不吸烟、吸烟每天大于20支三组比较无统计学差异；不吸烟组与吸烟每天小于或等于20支突变率比较无统计学差异；吸烟每天小于或等于20支者与吸烟每天大于20支者突变率比较无统计学差异，见表2。

表2 E19-Del突变与吸烟量分层特征

表1 E19-Del突变率与临床分层特征

四、L858R突变情况与临床特征

498例非小细胞肺癌中L858R突变45例，突变率9.036%，其女性突变率15.026%，男性突变率5.246%，两者比较有统计学差异。不吸烟组L858R突变率12.355%，吸烟每天小于或等于20支突变率5.488%，吸烟每天大于20支突变率5.333%，三组比较有统计学差异。腺癌L858R突变率10.565%，其它类型其突变率2.198%，两组比较有统计学差异。未发生胸膜转移组L858R突变率7.051%，发生胸膜转移突变率12.366%，两组比较有统计学差异。L858R突变特征还表现在：年龄分层越大突变率越高，大于等于70岁其突变率最高，分期中突变率由高到低依次是Ⅱ期、Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期，并发其它肿瘤组突变率高于未并发其它肿瘤，合并骨转移、淋巴结转移的突变率高于无转移组，头颅未转移的突变率高于有转移组，无糖尿病、高血压者突变率高于合并糖尿病、高血压组，右肺肿瘤突变率高于左肺肿瘤，但均无统计学差异，见表3。

讨 论

据报道在北美和西欧约10%的病例存在EGFR突变，但其中30%～50%病例属于东亚血统[10]。不同种族中EGFR表达率不一样[11]，既往研究证实，在亚裔、非吸烟、女性腺癌患者更常见[12]，即 E19-Del和L858R更常见不吸烟者，本文中E19-Del、L858R突变率均是非吸烟组高于吸烟组，吸烟量越大突变率越低，E19-Del突变率在不吸烟组与吸烟每天大于20支组有统计学差异，L858R突变率在不吸烟组、吸烟每天小于等于20支组、吸烟每天大于20支组三组间有统计学差异。EGFR突变在肺鳞状细胞癌中极少，鳞癌中偶然检测到被一些人认定为对腺鳞癌或低分化的病例误诊[13]。本文中E19-Del、L858R突变率腺癌高于其它类型肿瘤，L858R在并发胸膜转移组突变率高于无胸膜转移组，可能与胸膜转移主要发生于腺癌患者，以上均有统计学差异，结论与既往研究相符，表明EGFR-TKI治疗更适宜这种特征的患者。其次，E19-Del、L858R突变率虽均是女性高于男性，L858R突变率性别差异有统计学意义，但E19-Del突变率性别差异无统计学意义，分析可能与入选病例男女性别数有关，后续进一步用大样本验证。

表3 L858R突变率与临床分层特征

国外有研究表明，肿瘤分期也会影响突变率。Sloan Kettering组得出在多个治疗后复发、转移的大型队列中，EGFR突变率为27%[14]，本文结果中E19-Del分期突变率由高到低依次是Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期、Ⅱ期，且Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期及Ⅲ期、Ⅳ期的相互比较为分期越晚突变率越高，且有统计学差异。L858R分期突变率由高到低依次是Ⅱ期、Ⅳ期、Ⅰ期、Ⅲ期，无统计学差异，这点和既往研究结论以及E19-Del分期突变率不同，考虑一方面入选病例大部分是临床分期，部分和术后分期存在一定差异。

本文结果还发现，并发骨转移组E19-Del、L858R突变率高于无骨转移组；脑转移组E19-Del突变率高于无转移组，L858R相反；淋巴结转移组L858R突变率高于无转移组，E19-Del相反。E19-Del、L858R突变率在未并发糖尿病、高血压的NSCLC组高于合并糖尿病、高血压组。未并发其它肿瘤组E19-Del突变率高于并发其它肿瘤组，L858R相反。发生于左肺的非小细胞肺癌E19-Del突变率高于右肺，L858R相反。由此可见，E19-Del、L858R突变率与未合并糖尿病、高血压、并发骨转移正相关，E19-Del、L858R在肿瘤发生部位、并发其它肿瘤和是否并发脑、淋巴结转移时突变率与临床特征相反。其次，E19-Del突变率在年龄小于50岁组最高，且小于50岁、大于等于50岁而小于70岁、大于等于70岁三组突变率有统计学差异；L858R年龄分层越大突变率越高，综上，E19-Del突变易发生于年轻患者，L858R突变易发生于年老患者。

研究显示，外显子E19-Del和L858R基本都是早期参与肿瘤克隆事件，而且当这些突变被靶向时，通常在多个癌症部位观察到反应[15]。但在携带E19-Del突变的NSCLC病例中疗效优于L858R突变的患者[16]，因此E19-Del、L858R突变的临床特征和疗效之间存在相关性。此外，既往研究证明如果患者只有E19-Del或L858R突变，可从第一代EGFR-TKI药物中获益[17]。一旦患者有双重突变E19-Del和T790M或E19-Del和L858R，他们将不会受益于第一代EGFR-TKI药物，可能会受益于第三代EGFR-TKI药物[18]。

总之，NSCLC患者EGFR常见突变基因突变临床特征差异与民族、遗传学背景、环境因素、检测方法等多种因素相关，本文结果通过498例以陕西省及周边地区为著的NSCLC患者E19-Del、L858R突变临床特征研究，分析突变临床特点，有助于进一步思考、探索、优化本地区NSCLC个体化治疗。