ATG16L1基因多态性与广西壮族人群炎症性肠病的关系

陈 兰，吕小平*，詹灵凌，唐星火

(1广西医科大学第一附属医院西院，南宁 530021，2广西医科大学第一附属医院临床医学实验部)

炎症性肠病(IBD)是一组病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，常见类型为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。国外文献证实，ATG16L1基因 SNP多态性位点 rs2241880为白种人 CD发病的易感基因之一[1，2];我国智佳等[3]报道自噬体基因 ATG16L1多态性与 IBD无明显相关性。为此，我们对广西壮族 IBD患者基因多态性与 IBD的关系进行了研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集 2007年 2月 ～2010年 10月在广西医科大学第一附属医院就诊的广西无亲缘关系的 IBD患者 146例(病例组)，男 74例、女 72例，年龄(38±11)岁;其中 UC 86例，CD 60例;UC及CD诊断标准参照中华医学会消化病学分会 2007年对 IBD诊断治疗规范的建议，并排除合并其他自身免疫性疾病。UC患者中病变部位位于直肠 45例，左半结肠 21例，右半结肠 12例，全结肠 8例;CD患者中病变部位位于小肠 32例，结肠 16例，小肠合并结肠 7例，直肠 5例。146例 IBD中，壮族 70例，汉族 76例。另取广西无亲缘关系的正常对照组 164例，男 81例、女 83例 ，年龄(42±9)岁;其中壮族 80例，汉族 84例。两组性别、年龄比较差异无统计学意义。

1.2 方法 ①基因组 DNA提取:收集两组肠黏膜组织(30～50 mg)，保存于液氮罐中。将新鲜标本用生理盐水清洗干净、剪碎，加入 450μl TES、50μl SDS(10%)和 5μl蛋白酶 K(20 mg/ml)，混匀后放在 65℃水浴中 4～6 h;加入等体积苯酚，混匀后在 4℃、12 000 r/min离心 10 min。提取上清液于另一试管，加入等体积酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)，混匀后在 4℃、12 000 r/min离心10 min。提取上清液于另一试管，加入等体积氯仿、异戊醇(24∶1)，混匀后在 4℃、12 000 r/min离心10 min。提取上清液，加入 99%乙醇反复抽吸后出现白色絮状物，在 4℃、12 000 r/min离心 10 min，去掉上清液;在白色絮状物中加入 75%乙醇混匀，在 4℃、12 000r/min离心 5 min，去掉上清液，加入 50～100μl TE溶解，-20℃保存。②引物序列:包含 rs2241880位点的扩增长度为 193 bp，上游引物为 5'-ATTTGATGAGCAGTAAACCTCTG-3';下游引物为 5'-GGGGCTGAAGCATACTTACG-3'，特异性引物扩增ATG16L1基因的目的基因片段。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。③PCR扩增:PCR反应总体积为 25μl，其中包含 2×PCR缓冲液 11.5μl、去离子水10.5μl、DNA 1μl、10 μmol/L上下游引物各 1 μl。95℃预变性 5 min，95℃变性 40 s，58℃退火 30 s，72 ℃延伸 50 s，共 28次循环 ，最后 72℃彻底延伸10 min。PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶电泳并在紫外分析仪下分析鉴定，观察电泳结果。④PCR产物核苷酸序列测定:将 PCR产物切胶纯化，采用切胶纯化试剂盒将目的片段纯化回收，分光光度计检测纯化产物浓度，并将纯化后的 PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序，测序仪为美国SIB3730XL测序仪。

1.3 统计学方法 采用 SPSS16.0软件包，根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律进行遗传平衡检验，各组的基因型比较采用 χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增产物电泳结果 见图1、2。

图1 壮族人PCR扩增目的基因片段的凝胶电泳图

图2 汉族人 PCR扩增目的基因片段的凝胶电泳图

2.2 PCR产物核苷酸序列测定 测序图显示ATG16L1基因第 9外显子第 47位等位基因位点为等位基因多态性位点，该位点由苏氨酸突变为丙氨酸(ACT变为 GCT)，纯合突变(GG)为黑色单峰，纯合未突变(AA)为绿色单峰，杂合突变为黑、绿色双峰。

2.3 ATG16L1基因测序结果 ①壮族病例组与其对照组比较:两组样本遗传平衡检验差异无统计学意义(P＞0.05)，表明样本具有代表性。壮族病例组与对照组 ATG16L1基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P均 ＞0.05)，见表1。②汉族病例组与其对照组比较:两组样本遗传平衡检验差异无统计学意义(P＞0.05)，表明样本具有代表性。汉族病例组与对照组 ATG16L1基因型及等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P均 ＞0.05)，见表2。

表1 壮族病例组与对照组ATG 16L1基因型及等位基因频率分布

表2 汉族病例组与对照组ATG 16L1基因型及等位基因频率分布

3 讨论

ATG16L1基因主要表达于肠上皮细胞、淋巴细胞及巨噬细胞，其编码的 ATG16L1蛋白与自噬蛋白ATG5和 ATG12形成复合物，在处理细胞内细菌感染时发挥重要作用;Rioux等[4]证实敲除 ATG16L1基因会降低 HeLa细胞对沙门氏菌的吞噬作用。Cadwell等[5]报道了 ATG16L1在 Paneth细胞中的独特作用。Paneth细胞是小肠内的一种上皮细胞，分泌 ATG16L1蛋白，含有抗菌肽和溶菌酶颗粒;异常Paneth细胞分泌颗粒缺乏，导致清除微生物的能力下降。ATG16L1缺陷会阻断 ATG12-ATG5结合到细胞膜，从而影响微管连接蛋白 1轻链 3结合到磷脂酰乙醇胺，最后影响自噬体形成，导致自噬过程障碍及一系列病原体清除能力下降[6]。另外，在缺乏ATG16L1表达的巨噬细胞中由细菌内毒素刺激下会产生大量炎症因子，如 IL-1和 IL-18。

IBD基因易感性涉及多个位点，且有着种族差异性。Hampe等[7]研究发现，通过全基因组扫描及回归分析筛选出与 CD相关的 ATG16L1基因 SNP位点 rs2241880，并通过大样本实验证实欧洲人此位点的多态性与 CD易感性相关，与 UC无关，且此突变位点导致 CD的发病风险与 CARD15显著相关。目前该位点与 CD的关系已在新西兰、德国、荷兰、匈牙利、美国、英国人群中得到反复验证;且在英国[8]此位点只与成人 IBD有关，与儿童 IBD无关;而在澳大利亚[9]人群中的研究显示 ATG16L1基因SNP位点 rs2241880与回肠型 CD相关，同时首次报道与 UC的发生显著相关。另外，在部分匈牙利人群[10]及德国人群[11]研究中均发现 ATG16L1与CARD15之间未明显增加 CD的发病风险，而是独立存在的危险因素。然而在亚洲国家报道中，IBD患者的 ATG16L1基因位点 rs2241880的多态性与CD易感性无关[12，13]。由此我们认为，可能ATG16L1基因的多态性随种族和区域的不同而异。

本实验未发现广西壮族 IBD患者中 ATG16L1基因位点rs2241880的多态性与 CD、UC相关，这与中国其他省份研究结果一致，据此推测 ATG16L1基因SNP位点rs2241880可能与我国 IBD无关。在其他国家和地区报道 ATG16L1基因 SNP位点 rs2241880与IBD患者有相关性，可能是由于种族和地理位置的差异性所致。

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