慢性乙型肝炎病毒感染者HBcAg特异性细胞毒性T细胞克隆的建立*

何长伦 王寿明 郑纪山 张益红 唐雨德

HBV是一种具有包膜的双链DNA病毒，一般认为其非直接致细胞病变，HBV感染引发的急、慢性肝炎是人体免疫系统在清除HBV感染的过程中对肝细胞破坏的表现[1]。在免疫系统清除肝细胞中HBV时起核心作用的是HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL，即为活化的CD8+T细胞）。在对慢性HBV感染者的一些研究中，由于样本量和研究方法的不同，研究者发现HBV特异性CTL在抗病毒方面的作用的结果不尽相同[1～3]，表明慢性乙型肝炎免疫发病机理的复杂性。由于HBV宿主范围窄，难以建立合适的HBV感染动物模型，体外建立HBV抗原特异性CTL克隆成为研究病毒与宿主免疫反应的重要方法之一。我们采用HLA-A限制性表位肽刺激和有限稀释法，建立了慢性乙型肝炎患者外周血特异性T细胞克隆，并对所获得的细胞克隆的特性进行了分析。

材料与方法

一、病人 男性慢性乙型肝炎患者，40岁。诊断依据中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会2000年联合修订的《病毒性肝炎防治方案》。血清 HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性以及HBV DNA阳性，抗-HAV-IgM、抗-HCV、抗-HEV以及抗-HIV均为阴性。未进行抗病毒治疗。

二、主要试剂 RPMI-1640培养基（Gibco公司），HLA-A位点高分辨分型试剂盒（PEL-FREEZ公司），丝裂霉素C（MMC，Sigma公司），重组人白介素-2（rhIL-2，R＆D公司），重组乙型肝炎核心抗原（rHBcAg，Prospec公司），乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒检测试剂盒（Promega公司），流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司），鼠抗人CD8-PE和CD3-FITC（深圳晶美生物公司），鼠抗人CD4-FITC、抗IFN-γ-FITC/抗IL-4-FITC 单克隆抗体（Mabtech公司）。

三、人白细胞相关抗原A位点（HLA-A）高分辨检测 采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCRSSP）分型技术。简要步骤如下：取EDTA抗凝血2ml，过柱吸附法提取DNA，PCR扩增。扩增产物电泳后在紫外透射仪下观察结果并照相。应用PEL-FREEZ SSP分析软件判断结果。

四、抗原肽合成 经上述方法测得该例患者的HLA-A等位基因为2402/—。选择并合成HBV核心（HBc）117-125[4]作为 HLA-A*2402 限制的 CTL 表位肽，长度为9个氨基酸，序列为EYLVSFGVW，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。经高压液相色谱仪纯化后冻干，纯度＞98%。冻干肽以20mg/ml二甲亚砜溶解，再以1mg/ml用无血清RPMI 1640培养液稀释，-20℃保存备用。

五、外周血单个核细胞（PBMC）的制备 取肝素抗凝外周静脉血4ml，加等量无血清RPMI-1640培养液稀释混匀，用人淋巴细胞分离液2000rpm/min离心20min，收集PBMC层。用无血清RPMI-1640培养液洗涤、离心3次，作细胞计数。

六、饲养细胞的制备 自体或异体PBMC用于制备饲养细胞。异体PBMC来自志愿者，未感染过乙型肝炎病毒，为HAL-A*24。调整细胞数至1×106/ml，按25μg/ml加 MMC，37℃水浴 40min，使细胞失去增殖能力，用无钙、镁Hanks液洗涤2次，去除MMC，备用。

七、抗原肽和rHBcAg刺激PBMC培养 取PBMC 2×106/ml悬于RPMI-1640完全培养液（含2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mM HEPES，10%AB型热灭活人血清）中，加入抗原肽10μg/ml、rHBcAg 1μg/ml。加于 24 孔培养板，1ml/孔。实验第3天和第10天补加1ml完全培养液，并加入rhIL-2（终浓度10U/ml）；第7天换部分液体并加抗原肽、rhIL-2和自体饲养细胞（2×106/孔）。第21天测细胞毒活性并进行克隆化。

八、HBcAg特异性T细胞克隆的建立 采用有限稀释法，在96孔培养板上分别按1、3个细胞/孔添加上述激活细胞，同时加入抗原肽（1μg/ml）、rhIL-2（100∪/ml）、PHA（1μg/ml） 和异体饲养细胞（2×105/孔）。间隔7天重复加刺激物和饲养细胞。根据克隆细胞生长情况扩大培养，每3天换部分液体，每10天重复刺激1次。根据需要进行亚克隆。对照孔只加异体饲养细胞、rhIL-2和PHA。

九、细胞毒试验

（1）靶细胞：采用经EBV诱导建立的自体B淋巴母细胞系（B-LCL）（建系方法见文献[5]）2×106/ml，与合成的抗原肽10μg混合过夜，洗去游离抗原肽后，即为靶细胞；（2）细胞毒检测：采用LDH释放试验，加靶细胞5000/管，效应细胞与靶细胞各50μl混合，低速离心后，在5%CO237℃孵育4h，取上清 50μl加LDH基质液50μl，室温避光育30min，加中止液，在酶标仪测490nm 透光值（A）；（3）计算公式：细胞毒活性（%）=（实验孔A值-效应细胞自发释放孔A值-靶细胞自发释放孔A值）/（靶细胞最大释放孔A值-靶细胞自发释放孔A）×100%

十、流式细胞仪分析

（1）细胞表面标记：克隆细胞经PBS洗涤1次，分别与鼠抗人CD3-FITC/CD8-PE/CD4-FITC单克隆抗体室温避光孵育30min，洗去游离抗体，经流式细胞仪分析10000个细胞，分析克隆细胞的表面标记；（2）细胞内细胞因子：培养细胞按2μg/ml加入rHBcAg，于 37℃ 5%CO2培养 1h，再按 10μg/1ml加入 BFA，继续培养5h，收集细胞，洗涤后经固定、破膜，并分别与FITC标记的抗IFN-γ/IL-4室温避光放置30min，洗去游离抗体后，加2%多聚甲醛500μl，经流式细胞仪分析10000个细胞，分析克隆细胞的细胞内细胞因子。为避免饲养细胞产生细胞因子的影响，在最后一次添加饲养细胞后至少15天再进行检测，并以单独培养的饲养细胞和未染色的克隆细胞作本底对照。

结果

一、HLA-A基因分型结果 应用PCR-SSP分型技术，该例慢性乙型肝炎患者的HLA-A等位基因组合为2402/—（图1）。根据文献报道[4]，选择相应的CTL优势表位肽—HBc117-125作为乙型肝炎特异性T细胞株的抗原刺激物，长度为9个氨基酸，序列为EYLVSFGVW。

图1 慢性乙型肝炎患者HLA-A*2402/—

二、HBc表位特异性CTL的诱生 新鲜分离的PBMC经rHBcAg及抗原肽刺激3周后，测得的细胞毒活性为43.7%，提示PBMC中的表位特异性CD8+被激活。

三、T细胞克隆的建立及细胞表面标记分析 将抗原肽激活的PBMC通过有限稀释法进行克隆化，获得了11个细胞克隆（图2），克隆形成率为11.4%（11/96），以饲养细胞作对照的20个孔中无细胞生长。经荧光抗体染色和流式细胞仪分析，在11个克隆细胞株中9株为CD3+/CD4-/CD8+T细胞株，CD3表达率为90.2%～97.6%，CD8表达率为87.3%～92.2%，CD4表达率为1.4%～4.6%；另2株为CD3+/CD4+/CD8-T细胞株。

图2 生长14天的细胞克隆

四、细胞内细胞因子情况 在9株CD8+T细胞克隆株中有2株仅表达IFN-γ（Tc1），4株表达IFN-γ和IL-4（Tc0），3 株仅表达 IL-4（Tc2）。2 株 CD4+T 细胞克隆均同时表达IFN-γ和IL-4（Th0）。

五、CD8+T细胞克隆的特异性细胞毒活性 分别采用效靶比例为 1：1，2.5：1 和 5：1，结果见图 3。

图3 CD8+T细胞克隆的特异性细胞毒活性

讨论

在急性HBV感染者能检出对HBV多种抗原强烈的特异性CTL反应，其特异性细胞毒反应可达40%～80%，而在慢性乙型肝炎则不然，特异性细胞毒反应往往低于20%[6]。但在某些能够自然清除HBeAg或/和HBsAg的慢性感染者以及慢性乙型肝炎急性发作或称为肝炎突发（hepatitis flares）状态的患者，其HBV特异性CTL的数量增多，特异性细胞毒反应也有升高[6，7]。本文在1例慢性乙型肝炎突发患者[8]，就诊时ALT达正常10倍以上，入院后病情趋于好转，ALT下降，但始终未达正常，HBV DNA表现为低水平复制（2×105copies/ml），HBsAg阳性，HBeAg阴性。取患者急性发作期的PBMC在经表位肽刺激后，对结合有表位肽的靶细胞的细胞毒活性达到43.7%，与文献报道相似[6]，提示特异性CTL活性增高与慢性乙型肝炎急性发作有关。

特异性CD8+T细胞的激活及其生物学效应的产生受到HLA-I，特别是HLA-A的限制。在近年来发现的HBV特异性CTL识别的诸多表位中，绝大部分是HLA-A2限制的，对HLA-A2阳性HBV感染者特异性 CTL 的研究报道也较多[6，9，10]。HLA-A*2402 是我国常见的等位基因型之一，但关于该基因型的HBV特异性 CTL 的报道较少[2，3，11]。本实验中 HBV 感染者为HLA-A*2402/-，所选刺激抗原必须是HLA-A*2402限制的CTL表位。中国人群流行的乙型肝炎基因型（B型和C型）与欧美流行株不同，故以国外文献报道的HBV的CTL表位氨基酸序列作参照序列，国内李晓东等[12]发现 HBV特异性CTL表位氨基酸序列变异发生频率较高，其中作为HLA-A*2402限制性表位的HBc23-31在B型和C型的变异发生率分别达到31%和16%，而HBc117-125则未见变异发生。据此，我们选择了HBc117-125作为本实验研究中的CTL激活抗原。实验中HBc117-125能够激活PBMC中的CTL，并在随后的细胞毒试验中得以证实，该结果进一步表明HBc117-125是HLA-A*2402限制的CTL特异性优势表位。

有限稀释法常被用于CTL前体细胞或记忆细胞的频数分析（有限稀释分析，LDA）[13]，也用于目标细胞的克隆化[14]，虽然操作繁琐，耗时长，却能有效地获得高纯度的目标细胞群。我们应用该法获得11株能持续培养的T细胞克隆，克隆率为11.4%。在9株CD8+T克隆均具有细胞毒活性，其中2个Tc1型克隆细胞株的细胞毒活性（85.4%，90.2%，效靶比例为2.5：1）高于Tc0/Tc2株（39.1%～60.4%）。该结果是Tc亚型的特点还是仅为所建克隆株的特点，由于细胞株较少，有待在今后的研究中进一步观察。

与有些报道采用HLA-I部分匹配的异体B-LCL作靶细胞不同[6]，本实验采用自体B-LCL作靶细胞，因此是HLA-I完全匹配的。在实验中我们也曾采用异体B-LCL作靶细胞，HLA-A基因组合为2403/2409，细胞溶破率低于用自体B-LCL作靶细胞的结果，但差异无统计学意义（资料未列出）。

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