乙型肝炎病毒B和C基因型S蛋白特异性CTL表位保守性分析

陈庆新，李文姝，陈卓艳，何佳莉，汪文寰，林茂，叶菊秀

（温州医科大学，浙江 温州 325035，1.微生物学与免疫学教研室；2.眼视光学院）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在中国高度流行，根据HBV基因序列，可将世界范围内的HBV分为A-H 8个基因型，各基因型间核苷酸序列同源性差异超过8%，我国流行的HBV基因型主要为B和C型[1]。HBV感染过程中的免疫耐受和免疫逃逸是HBV慢性感染发生的重要致病机制[2]，而HBV特异性的细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）介导的细胞免疫应答，是最终清除HBV的关键，因此对国内流行基因型的CTL表位进行对比分析，将有助于了解HBV免疫逃逸特点，从而找到稳定特异性CTL靶点，为HBV感染后的治疗奠定基础。

本研究主要对HBV在国内流行的B和C基因型S区基因编码蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位进行了生物信息学筛选，CTL表位长度选择为9个氨基酸，结合已鉴定和报道的表位及GenBank中已有的B和C基因型进行比较，寻找稳定的B和C基因型S区基因编码蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位，探索可以用于HBV细胞免疫治疗的表位。

1 材料和方法

1.1 试剂与载体 pIRES载体、pGEM-T-HBV全基因组（HBV C基因型）重组载体由本实验室保存，Proteinase K购自德国Merck公司。IPTG、Ampicilin、X-Gal、进口CaCl2、胰蛋白酶（1∶250）、UNIQ-5柱离心式胶回收试剂盒、Taq plus DNA Ploymerase及dNTP Mix等购自上海生工生物工程有限公司。T4 DNA连接酶购自大连TAKARA公司。LB液体培养基、LB固体培养基、CaCl2溶液购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HBsAg基因的克隆和载体构建 根据HBV全基因组，设计一对引物，上游引物：5’-AGCTGCTAGCTCC GGAACAGTAAACCCTG-3’，含Nhe I酶切位点；下游引物：5’-GCCGATTAGGGTTCAAATGTA-3’，含Mlu I酶切位点。以pGEM-T-HBV全基因载体为模板，PCR扩增可得到长度为789 bp的HBsAg目的基因，将PCR产物用Nhe I和Mlu I双酶切后进行纯化，与同样酶切纯化后的pIRES混合，加入T4 DNA ligase置16 ℃恒温仪连接过夜，转化大肠杆菌DH5α。PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海基康公司DNA测序。

1.3 候选CTL表位预测 选择HBV B基因型（D00330）和C基因型（AB033556）的S区基因序列，采用BIMAS、NetMHC和SYFPEITHI[3]预测软件分别预测S区基因编码蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位。SYFPEITHI预测得分大于21作为CTL表位选择条件，NetMHC预测结果中选择affinity binding level＜50 nmol/L的CTL表位，BIMAS预测得分大于25作为CTL标为选择依据。

1.4 候选CTL表位分析 将3种预测软件筛选出的高分CTL表位进行分析，在BIMAS、NetMHC和SYFPEITHI中的至少2个预测软件中都具有较高的预测得分选定为候选CTL表位；通过BLAST检索HBV蛋白库，分析候选CTL表位在大量HBV B和C基因型中保守性；将候选表位是否在其他文献中已经被鉴定过进行标注。

2 结果

2.1 HBsAg基因的克隆和鉴定 PCR产物核酸电泳可见大约0.8 bp的片段，与预期789 bp相符（见图1）；重组载体pIRES-HBsAg酶切后可以得到6 100 bp的载体片段和800 bp的目的片段（见图2），测序分析显示与HBV S基因序列一致，说明HBsAg基因已经克隆并成功构建pIRES-HBsAg真核表达载体。

图1 HBV S基因的PCR产物核酸电泳图

图2 pIRES-HBsAg重组质粒的酶切鉴定结果

2.2 预测CTL表位得分情况 根据HLA-A*0201限制性和9肽等条件，通过BIMAS、NetMHC和SYFPEITHI等方法对选择序列分别进行分析后得到如下结果。SYFPEITH分析共得到18个评分大于21的CTL表位（见表1）。NetMHC对CTL表位的亲和性分析后，根据评分和亲和力共得到了14个亲和性高的CTL表位（见表2）。BIMAS对S蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位分子的解离半衰期进行评分，共预测得到20个可能存在的表位分子（见表3）。通过对表位在3种方法中的得分情况进行综合分析对比后，最后共选择17个表位进入后续的保守性分析。

2.3 候选CTL表位保守性分析 对预测表位进行分数比较、B和C基因型的保守性比较、是否鉴定等进行综合分析后发现，预测表位在B和C基因型的保守性分析发现除了S205-213（SLDSWWTSL）、S261-269（ILLLCLIFL）、S257-265（FLFILLLCL）、S270-278（VLLDYQGML）和S250-258（CLRRFIIFL）等保守率能够达到80%以上，其余表位保守性较低。已经鉴定过的表位发现，这些表位在B和C基因型中的保守性也较低，其中S215-223表位在C基因型中保守性为0%，在B基因型中则是70.2%；而S131-139和S194-202是在C基因型中保守性较高，B基因型中保守性较低，同样在未鉴定表位（S255-263和S276-284）中也存在相同现象（见表4）。

表1 SYFPEITHI预测S区编码蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位

表2 NetMHCI预测S区基因编码蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位结果

表3 BIMAS预测S区基因编码蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位结果

表4 候选HLA-A*0201限制性S区基因编码蛋白CTL表位的综合分析

3 讨论

HBV感染会导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等严重后果，而国内感染者众多，清除慢性感染者体内HBV是一项艰巨而复杂的任务[4]。HBV特异性细胞免疫应答的建立是最终清除HBV感染的根本途径，因此对HBV CTL表位的选择就显得至关重要[5]。在研究HBV表位的时候，应选择与国内流行的B和C基因型一致的表位，否则可能会影响其在国内的临床应用[6-8]。本研究结果显示蛋白库中HBV B和C基因型的S区基因编码蛋白特异性CTL表位与已鉴定CTL表位存在较大差异，这些差异会影响细胞免疫到对HBV的识别，所以选择保守性高的CTL表位对国内HBV感染后的免疫治疗具有重要意义。

本研究成功克隆HBV S基因并构建真核表达载体，通过HBV B和C基因型的S区基因编码蛋白的生物信息学分析，共筛选到17个CTL表位肽，其中已经鉴定过的有6个表位，其余表位均是未鉴定表位，保守性分析显示S区基因编码蛋白在B和C基因型中保守性不高，未鉴定的表位中有6个表位在HBV B和C基因型中保守率均超过80%，已鉴定表位在B和C基因型中保守性相对较低。这些结果显示S区基因是B和C基因型间差异的重要区域，由于S区基因的变异，导致CTL表位的改变。HBV CTL表位保守性分析提示通过S区基因编码蛋白表位的变异是HBV逃避机体的免疫应答，进而形成持续性感染和免疫耐受的重要机制。

研究发现不同HBV基因型感染人体后会导致不同的临床结局，C基因型比B基因型更能引起患者的肝脏纤维化和肝癌的发生[4，9-10]。通过对S区基因编码蛋白表位的保守性分析发现，S215-223表位在B基因型中保守率较高，而在C基因型中保守率为0，S131-1139、S194-202、S255-263和S276-284等表位在C基因型中保守率高，而在B基因型中保守率极低，说明这些表位具有型特异性，其是否与B型和C型致病性差异有关，需要通过进一步研究证实。另外，也可以将这种型特异性表位用于HBV基因型的分型鉴定[11]。

本研究克隆HBV S基因，构建真核表达载体，并对国内流行广泛的乙型肝炎病毒B和C基因型中S区基因编码蛋白的存在的可能表位进行了生物信息学筛选，分析了被筛选表位在B和C基因型中的保守性，共得到6个特异性CTL表位肽，它们在B和C基因型间均具有较高的保守性，为HBV表位在国内的进一步研究和应用提供数据支持。