琼脂糖/ε-PLL/CHA屏障膜的制备及其抑菌能力和生物性能评价

何智琪，钱秋萍，邓辉，胡荣党

（1.温州医科大学附属口腔医院 正畸科，浙江 温州 325027；2.温州生物材料与工程研究所 生材事业部，浙江 温州 325000；3.温州医科大学附属口腔医院 牙周科，浙江 温州 325027）

近年来用引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR）术修复牙周组织缺损在临床开展广泛。其中屏障膜在GTR术中扮演着重要角色。最常用的屏障膜是可吸收性膜，如聚合物膜[1-2]、胶原膜和组织膜[3]等，但都存在着缺乏骨诱导活性和抗菌能力不足等的缺点。因此以简单工艺制备具有一定促进牙周组织再生及抗菌性能的屏障膜具有重要意义。

碳酸羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite，CHA）的成分与自然骨相近，相较于传统的羟基磷灰石（hydroxyaptite，HA）具有更好的生物相容性，更易于新骨组织的生长[4-5]。ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PLL）是由赖氨酸残基ε-氨基和α-羧基形成的单体聚合物。研究表明ε-PLL在具有良好生物安全性的同时，具有广谱抗菌活性[6-7]。为此，本研究采用具有高亲和及多孔惰性的琼脂糖水凝胶包载CHA和ε-PLL以通过简单工艺制备具备抗菌作用的GTR屏障膜。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：琼脂糖、ε-PLL（上海麦克林公司），无水氯化钙、无水磷酸二氢钠、尿素、无水乙醇（上海阿拉丁公司），DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），Live/Dead染色试剂盒（美国Thermo公司），LB固体培养基（北京索莱宝公司），金黄色葡萄球菌（美国ATCC，25923）。

1.1.2 仪器：IKA T10分散机（上海珂淮仪器有限公司）、流变仪（美国TA公司）、傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）（德国布鲁克公司）、扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）（日本日立公司）、正置显微镜（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 CHA的制备：采用一步水热法合成。将摩尔比例在Ca/P=1.67的磷酸二氢钠（NaH2PO4），氯化钙（CaCl2）各自溶解在2 mL的水中，将以上2种材料制备成水溶液。然后，将CaCl2溶液滴加到NaH2PO4溶液中，并剧烈搅拌10 min后在溶液中加入0.45 mol/L的尿素，以在长时间水热反应中产生氨气调节pH，最后加入6 mL乙醇，使乙醇与水的比例控制在3∶1，将悬浮液放置于180 ℃中24 h以制备中空状的CHA。

1.2.2 FTIR分析：将CHA捣碎制成细小粉末，并制备成粉末压片，通过FTIR检测材料的红外吸收光谱，以确证CHA制备成功。

1.2.3 屏障膜的制备：将75 mg琼脂糖加入到5 mL水中，加热至90 ℃以上使其充分溶解，制备浓度为15 mg/mL的琼脂糖水溶液。将50 mg的ε-PLL加入使其浓度为10 mg/mL。随后加入质量/体积比（w/v）依次为1%、5%、10%的CHA，采用分散机充分混匀3 min后加入到模板中，直到温度下降到35～40 ℃琼脂糖凝固成膜。

1.2.4 屏障膜形貌表征：取屏障膜样品，冷冻处理后置于冻干机冻干。通过溅射金实现表面导电，最后SEM观察。

1.2.5 屏障膜机械性能检测：制备直径8 mm，高1 mm的屏障膜，流变仪器检测损耗模量和储存模量。

1.2.6 牙周膜细胞的原代培养：本研究所用的原代人牙周膜细胞样本采集自温州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊患者因为阻生而拔除的第三磨牙。所选患者符合如下标准：年龄范围为18～30岁，身体健康，无全身系统性疾病史，无家族遗传性疾病史，口腔卫生良好，无吸烟史。所收集第三磨牙符合如下标准：无牙体缺损、龋坏，牙齿所在部位无牙龈炎和牙周炎。本研究经温州医科大学附属口腔医院医学伦理委员会批准，事先告知患者并签署知情同意书。嘱患者术前漱口水含漱，常规消毒。第三磨牙一经拔除，立即用预冷的双抗PBS（含100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素）冲去牙根表面血渍，后浸没于含双抗的DMEM培养基中，保持低温，即刻送实验室。无菌刀刮取根中1/3部分的牙周膜组织，剪碎后转移至无菌EP管中，加入0.3% I型胶原酶100 μL消化组织块，37 ℃培养箱孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入双抗PBS吹打混匀，继续1 000 r/min离心5 min后弃上清。在管内加入1 mL完全培养基（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基），吹打均匀后接种至T25培养瓶，待细胞长至70%到80%时消化传代，采用抗角蛋白和抗波形蛋白染色鉴定细胞来源，取3～5代细胞用于后续实验。

1.2.7 屏障膜生物相容性检测：首先将屏障膜进行灭菌处理，经紫外线照射30 min后75%乙醇浸泡2 h，无菌PBS溶液反复冲洗并吸干。每孔中加入300 μL DMEM培养基，浸泡过夜，吸干后置于48孔板。选择3～5代牙周膜细胞，用含10% FBS的DMEM培养基配成浓度为5×104/mL的细胞悬液。以300 μL/孔将细胞悬液接种于置有屏障膜的孔板内，放于标准细胞培养箱中孵育14 d（每3 d换液），按试剂盒说明进行细胞Live/Dead染色，在荧光显微镜下观察。绿色荧光标记的是活细胞，红色荧光标记的是死细胞。

1.2.8 屏障膜生物体外抗菌性能检测：取200 μL浓度为106CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液接种于LB固体培养基。将直径8 mm屏障膜圆片放于其上，标准细胞培养箱中培养24 h，游标卡尺测量屏障膜周围抑菌环宽度。

2 结果

2.1 CHA的制备 在10 000倍的SEM下我们可见到中空柱状的CHA（见图1A）。通过红外光谱我们可以看到PO43-基团（1 040、960、603、570和437 cm-1），与HA的标准红外光谱特征峰基本吻合。此外，还看到在1 470、1 461、1 418及873 cm-1处CO32-的特征峰，说明成功合成CHA（见图1B）。

2.2 屏障膜的制备 SEM结果证实琼脂糖/ε-PLL膜内部有明显互通的大孔径的天然孔隙。随着CHA浓度增高，琼脂糖/ε-PLL膜的天然孔隙孔径逐渐减小，且在CHA浓度为10% w/v时，CHA部分团聚呈球状（见图2）。

2.3 机械性能 采用流变仪检测储存模量G’和损耗模量G”。在不加入CHA时，G’值为14 kPa，随着CHA浓度的增加，G’明显上升，在含有10%CHA时，G’超过34 kPa（见图3）。证实CHA提升琼脂糖/ε-PLL膜的机械性能。

图2 不同CHA浓度的屏障膜SEM图

图3 含有不同浓度CHA的屏障膜的机械性能

2.4 生物相容性 利用前期培养和鉴定的人牙周膜细胞，我们通过Live/Dead染色结果来检测屏障膜的生物相容性。在屏障膜上培养牙周膜细胞14 d以后，只可见很少量的死细胞。且随着CHA浓度的增高，活细胞数量明显增多，而死细胞数量未见增长。当CHA的浓度为10% w/v时，细胞呈现梭形，生长良好。见图4。

2.5 体外抑菌能力 在涂布金黄色葡萄球菌的培养平板上，可观察到半径为（4.11±0.35）mm的抑菌环，且不同的CHA浓度对抗菌效果无影响（见图5）。证实此屏障膜有良好的抑菌能力。

图4 不同浓度CHA的屏障膜的Live/Dead染色结果

图5 琼脂糖/ε-PLL/CHA屏障膜的抑菌环实验

3 讨论

慢性牙周炎是发生于牙周支持组织的慢性感染性疾病，导致牙周组织特别是牙槽骨的吸收破坏，是成年人失牙的最主要原因。传统的牙周基础治疗较难获得牙周组织的再生。NYMAN等[8]首先提出了GTR的概念，其原理是通过外科的方法在骨缺损部位放入屏障膜，阻挡牙龈结缔组织与根面接触的同时提供一定的空间，引导具有牙周组织再生潜力的牙周膜细胞优先占领根面，实现牙周组织再生。近年来GTR手术临床开展广泛，然而术后细菌感染常造成牙周组织再生明显减少甚至GTR手术失败[9]。

目前临床上使用的屏障膜可分为可吸收性和不可吸收性。可吸收性屏障膜由于避免了二次手术取出，应用更为广泛，其中又以胶原膜最为普遍。虽然胶原膜具有生物相容性好、抗原性低、易于操作等优点，但仍然存在机械强度不足，不具备抗菌能力等缺点[10]。基于口腔的有菌环境，这种屏障膜有发生术后感染的风险，易导致GTR手术效果不佳甚至失败。SUZAWA等[11]研究表明加入HA后的琼脂糖凝胶显著促进间充质干细胞的成骨分化。NASAJPOUR等[12]报道聚己内酯和氧化锌的复合膜能促进牙周膜细胞分化的同时还有良好的抗菌能力。因此以简单工艺制备具有一定促进牙周组织再生及抗菌性能的屏障膜具有重要意义。

HA作为一种人工骨材料，与骨骼主要成分相似，具有机械性能、生物相容性及骨传导性良好等优点，已广泛应用于临床[13-14]。CO32-取代HA中的OH-或PO43-，引起HA的晶格畸变，可成为CHA，在保持HA原有的良好生物相容性的同时，又显著提高其生物活性[4-5]。

ε-PLL是一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，通过赖氨酸残基的ε-氨基和α-羧基形成的酰胺键连接而成。其不但可以作为接枝材料[15]，还具有广谱抑菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等均具有抗菌作用。AMARIEI等[16]研究表明将ε-PLL掺入静电纺丝制成的PAA/PVA膜后细菌的定植明显减少。其同时具有良好的生物安全性，有研究表明其无毒剂量为10 000 ppm，且在30 000 ppm以下对生殖、神经系统及胚胎的发育和生长均无毒性，被认为是抗菌物质的良好选择之一[17]。

本研究采用了低成本的可物理交联的多孔惰性材料CHA/琼脂糖作为载体，包载具有广谱抗菌性能的ε-PLL，通过简单工艺的制备除了具有屏障功能，还能抗菌的屏障膜。

从FTIR结果图可以看到CO32-部分取代PO43-和OH-所形成的特征峰，表明成功制备出了CHA。CO32-是人骨磷灰石中最多的掺杂离子[18]，CHA较HA可更有利于细胞的黏附及骨向分化[19]。研究发现HA在模拟体液浸泡后在其表面形成花状的CHA，相较于HA具有更好的生物活性[20]。从SEM结果可以看到，高浓度的CHA可以减小琼脂糖的内部孔隙使屏障膜更好发挥屏障作用。并且由于CO32-的掺入可以有效提高CHA的机械性能[21]，流变实验也证实随着CHA浓度的升高，屏障膜的机械性能也逐渐增强，初步证实可以满足在人体内所需的机械性能的要求。从Live/Dead染色结果来看，死细胞数量极少，表明此屏障膜具有较好的生物相容性。可能由于不加CHA的琼脂糖凝胶硬度低，细胞生长较慢，因此可见琼脂糖/ε-PLL膜上细胞较少，但随着CHA浓度的增加，细胞数量逐渐增加，并且在CHA浓度为10% w/v时可见细胞铺展呈梭形。抗菌实验表明此屏障膜对金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌性能。今后还需要通过动物实验进一步研究。

综上所述，本研究以简单工艺制备了琼脂糖/ε-PLL/CHA膜，并初步证实其具有较好的力学、生物相容性和抗菌等性能。