水乳化法制备罗丹明B接枝琼脂糖荧光微球❋

李诚博， 程笑晨， 刘晨光

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

荧光微球在多领域都有广泛应用，例如污染检测[1-2]、生物标记[3]、体内或体外成像[4]、药物运送[5]、疾病诊断[6]、免疫分析等[7]。荧光微球可以通过多种材料进行制备，包括多聚物[8]、硅[9]以及磁性粒子[10]。常用的荧光微球制备方法有2种：第一种是制备微球时将染料与原料混合[11]，另一种方法是在微球成功制备后再添加染料[12]。在荧光微球中的制备过程中，通常使用有机染料和量子点做为荧光基团。然而，应用这些材料有许多缺点，例如使用量子点作为荧光基团会产生一定的毒性[13-14]，有机染料会导致光漂白现象的发生[15]，有些荧光染料甚至会发生荧光泄漏[16]。为了克服量子点和有机染料的不足，亟需探索新的制备方法。通过化学修饰得到的具有良好物化性质的多聚物是一种制备荧光微球材料的理想选择，因为这些材料具有抗光漂白特性以及荧光发射的均一性[17-18]等优点。

最近，由于荧光多糖材料的良好的相容性，其在微球的制备中受到了越来越多的关注。琼脂糖，是一种可以被广泛应用到生物医药和生物工程中的一种红藻多糖。由于其独特的性质，例如亲水性、多孔性、长时间稳定性以及无毒性[2,19]，琼脂糖成为一种理想的制备微球的材料。琼脂糖的基本二糖单元包括1,3连接的β-D-半乳糖和1,4连接的α-L-3,6-脱水半乳糖[20]。目前，对于荧光琼脂糖的研究有将琼脂糖与色氨酸接枝[21]，利用色氨酸的天然荧光特性使之具有荧光，另外还可将与萘乙酰[22]、腺嘌呤[23]等物质与琼脂糖接枝使之具有荧光，而没有关于单纯的琼脂糖与罗丹明B的荧光接枝产物的相关文章。本文将罗丹明B这种常见的荧光染料进行接枝荧光标记，可以减轻成本，同时也可以拓宽荧光指示材料的应用范围。此外，本实验中使用水水乳化的方法制备琼脂糖微球也具有很大优势，因为这个方法避免了有机溶剂[24]和表面活性剂的应用，从而减少聚集、降低污染[25]。

在本文中，我们选择罗丹明B作为荧光素合成了琼脂糖-罗丹明B(RB)接枝的多聚物(ARB)，检测了其物理和化学特性。此外，本文还通过水水乳化方法制备琼脂糖荧光微球并检测其荧光特性。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

主要材料和仪器：琼脂糖(BIOWEST公司)，环氧氯丙烷(天津广成化学有限公司)，罗丹明B(国药集团)，搅拌机(RW20，IKA)，荧光分光光度计(F-4500 FL Spectrophotometer，HITACHI)，荧光显微镜(Eclipse 50i，Nikon)，扫描电子显微镜(JSM-6380,JEOL)，傅里叶红外光谱仪(Impact 410，Nicolet)，X射线衍射仪(ARLTMEQUINOX 100 X，Thermo)，荧光酶标仪(VarioskanFlash,Thermo)。其余都为从国药集团采购的分析纯试剂。

1.2 琼脂糖的活化

琼脂糖的活化是将活泼的环氧基团引入琼脂糖凝胶上，琼脂糖凝胶与亲和配基在常温或低温下反应，可以制备亲和吸附介质。将0.3 g琼脂糖溶于3 mL蒸馏水中，将6 mL环氧氯丙烷溶液与21 mL蒸馏水混合。琼脂糖和环氧氯丙烷的终浓度分别为1%和5%，混合溶液体积为30 mL。使用NaOH调节溶液的pH为10，并用搅拌器80 ℃连续搅拌3 h即可。

1.3 罗丹明B的交联

活化后的琼脂糖与罗丹明B的羧基发生反应，起到化学交联的目的。取一定量的罗丹明B加入到活化后的琼脂糖中，并在80℃下持续搅拌3 h，琼脂糖与罗丹明发生接枝反应。随后，加入90 ml的无水乙醇使之沉淀，再将接枝产物进行冻干处理后，收集备用。反应示意图见图1。

(a.琼脂糖的羟基与环氧氯丙烷的-Cl在碱性环境中发生置换反应；b.中间产物随后与罗丹明发生接枝反应。a.One of hydroxyl groups of agarose replaced the -Cl of epichlorohydrin at the alkaline environment; b.The intermediate products grafted with RB subsequently.)

图1 琼脂糖与罗丹明接枝的反应示意图
Fig. 1 The reaction formula of agarose and RB

1.4 性质检测

显微镜定性观察。利用光学显微镜和荧光显微镜来观察修饰后的琼脂糖形态及其荧光特性。检测微观形态以及验证合成产物是否产生荧光。采用绿光激发罗丹明B产生红光，激发波长为580 nm，发射波长为610 nm。

红外检测。将2 mg样品与100 mg KBr混合研磨成粉末，再用压片机压成薄片。红外检测设定分辨率为4 cm-1，扫描数量为64遍，信噪比为25 000。记录光谱范围在400～4 000 cm-1。

X-射线衍射检测晶体性。对照实验选用空白样品，用塑料封装，得到平滑的背景，并且无扩散的晶体峰。X衍射采用的是粉末衍射仪，电压、电流分别为40 kV和150 mA。X射线衍射图案在角方位为20°～90°，步长为0.05°。晶格参数通过里特维德方法测定衍射模式[26]。

1.5 罗丹明接枝琼脂糖的荧光激发光谱与发射光谱

将修饰后的琼脂糖通过荧光分光光度计进行激发波长扫描与发射波长扫描检测。首先固定激发波长，在300～750 nm范围内进行扫描，每隔10 nm计数一次，绘制相应波长下荧光强度的散点图，为激发光的波长扫描图。同理，发射光的波长扫描图是固定发射波长，进行上述相同操作。由此分别确定最佳的发射波长和激发波长，并与罗丹明B进行对比，检测化学合成后荧光性质是否变化。

1.6 修饰后琼脂糖微球的乳化制备

罗丹明B修饰后的琼脂糖可以通过水油乳化法[27-28]或水水乳化法制备微球[29]。水油乳化法具体步骤如下：首先，将上述步骤制得的琼脂糖于80 ℃溶于水，配置成1.5%溶液，加入到含有1%司班80的液体石蜡中，按照水油两相比例为1∶8，加入琼脂糖3 mL，液体石蜡24 mL，80 ℃、1 600 r/min条件下乳化30 min，随后取出冰浴冷却固化，离心后冻干保存。

水水乳化法具体步骤如下：将上述步骤制得的琼脂糖溶于水中，加热至80 ℃使之溶解，配置成2%溶液作为分散相。PEG10000溶于水，按照质量体积比配制成20%水溶液。随后，将2.5 mL制得的琼脂糖溶液逐滴加入到25 mL的PEG溶液中，70 ℃、1 800 r/min条件下搅拌30 min。微球形成后，停止搅拌，将体系放入冰水浴中固化30 min。将固化后的体系进行离心冲洗3次，再进行冻干处理，随后室温保存。

1.7 微球的形态学观察

将微球分散到蒸馏水中后，使用光学显微镜观察其形态，在放大200×时，使用数字图像处理软件捕获显微照片。通过扫描电子显微镜(1 600×)观察琼脂糖微球细微形态。样品首先经过冻干处理，处理后的样品放在载玻片上，在充满氩气的空间中，溅射喷涂上金-钯层。涂层后的样品在20 kV的加速电压下观察，冻干后的微球大小、形态、粒径等。同时，微球的荧光特性可以通过荧光显微镜进行观察。在200×的放大条件下，采用绿色荧光激发，观察微球是否有荧光特性。

1.8 粒径分布

基于动态光散射的粒度分析仪可以用来检测和分析微球的各种参数。可以依据直方图及累积曲线进行随后的数据分析。平均粒径在该仪器中定义为D50，表示为所有微球按照粒径从小到大累积到50%时微球的粒径。检测时温度维持在25 ℃。

1.9 微球的荧光接枝稳定性

通过荧光接枝稳定性，来考察制备荧光修饰琼脂糖微球的必要性。本文制备了两种微球，一种为非接枝的荧光琼脂糖微球，即直接制备琼脂糖微球，在制备过程中包埋液体罗丹明B。另一种为采用修饰后的罗丹明B接枝琼脂糖荧光材料制备荧光微球。具体如下，用蒸馏水做对照，将0.1、0.5、1 mL的1%罗丹明B与1.5%的琼脂糖混合，采用水水乳化法制备微球。同时，将修饰后的琼脂糖设置两个梯度，初始罗丹明加样量分别为1.25%和5%(v/v)。将所有微球放入透析袋中，外部液体为蒸馏水，体系温度为37 ℃，于100 r/s转速轻微搅拌。按照时间间隔0、1、2、3、4、5、6、8、12、24、36、48、60 h，取出1 mL液体，随后用蒸馏水补齐体积。通过酶标仪测定浓度，激发波长580 nm，发射波长610 nm。

2 结果与讨论

2.1 罗丹明B接枝琼脂糖的合成与表征

罗丹明B与琼脂糖的修饰中间物为环氧氯丙烷。环氧氯丙烷是一种双功能试剂，带有环氧基团和-Cl基团。在活化的同时，琼脂糖能够达到一定程度的交联。不但能够增加琼脂糖的机械性能，还可以增强其对强碱和高温的耐受性。具体来说(见图1)，在碱性条件下，琼脂糖的一个羟基替代了环氧氯丙烷的-Cl，如反应式1。在相同的条件下，环氧氯丙烷的环氧基断裂，与罗丹明B的羟基相连，于是中间产物与罗丹明B也会发生连接反应，如反应式2。罗丹明B接枝的琼脂糖置于光学显微镜下观察，发现修饰后琼脂糖与单纯琼脂糖外观基本一致，之后我们又在同一视野中观察荧光特性，结果表明修饰成功表现为具有罗丹明B的荧光特性，即在绿光激发的条件下，显微镜视野中会出现发射红光的物质。

2.2 红外检测

为了更进一步确定罗丹明B和琼脂糖的接枝，我们将单纯琼脂糖，合成后琼脂糖分别进行红外光谱检测(见图2)。把单纯琼脂糖与修饰后琼脂糖作为一个单元对比，同时也将不同取代度的琼脂糖作为一个单元进行对比。

如图2a，罗丹明已经与琼脂糖进行了化学交联。琼脂糖在3 423.31 cm-1表现出羟基振动，在2 896.34 cm-1表现出碳氢键的伸缩振动，在1 640.95 cm-1表现出碳碳双键的伸缩振动，在1 371.77 cm-1表现出碳氢键的弯曲振动。对于修饰后的琼脂糖，在2 896.34和1 371.77 cm-1峰处有减弱现象，原因为接枝罗丹明B后碳氢键所占比例减少，导致所吸收的量在总体比例下减少。同时在2 357.47 cm-1处多出了一个峰，此峰代表了累积双键的非对称伸缩振动，代表了罗丹明B中的累积双键，由此可以证明罗丹明B已经经过化学交联与琼脂糖在一起。

(a．琼脂糖和罗丹明B接枝琼脂糖的红外光谱，绿线代表琼脂糖红外光谱，红线代表经过罗丹明B修饰的琼脂糖；b. 不同浓度的接枝琼脂糖的红外光谱。a. The IR spectroscopy of agarose and ARB; b. The IR spectroscopy of two different kind of ARB.)

图2 琼脂糖和罗丹明B接枝琼脂糖的红外光谱
Fig. 2 The IR spectroscopy of agarose and ARB

如图2b，从不同浓度的接枝琼脂糖的红外光谱可以看出，随着罗丹明B量的增加，2 357.47cm-1峰越强。由此可以从侧面说明罗丹明的取代程度与罗丹明B的添加量有关。

2.3 X-射线衍射检测

琼脂糖和修饰后琼脂糖的X衍射图谱如图3所示，所有的衍射图谱中都没有发现明显的高峰，意味着琼脂糖和修饰后琼脂糖都是无定形状态，即非晶体性。观察图像发现，修饰后琼脂糖的X衍射强度比单纯琼脂糖的强度低，这是因为在琼脂糖的基础上接枝罗丹明，会使结构更加紧密[30-31]，在相同的体积下，修饰后琼脂糖的密度大于单纯琼脂糖。

2.4 荧光激发光谱与发射光谱

罗丹明B修饰琼脂糖粉末在荧光显微镜下观察显示，当被绿光激发时，会发出红色荧光，与罗丹明B相同。这可以部分证实罗丹明B与琼脂糖接枝。同时，分别测量罗丹明B和罗丹明B接枝琼脂糖的激发光谱和发射光谱，并对比研究罗丹明B和罗丹明B接枝琼脂糖的荧光性质(见图4)。

(a．琼脂糖；b. 罗丹明B接枝琼脂糖。a. RB; b. ARB.)图3 琼脂糖和罗丹明B修饰琼脂糖的X衍射图像Fig. 3 The X-ray diffraction of agarose and ARB

(a．罗丹明B；b.罗丹明B接枝琼脂糖。a. RB; b. ARB.)图4 罗丹明B和罗丹明B接枝琼脂糖的激发光谱和发射光谱Fig. 4 Thefluorecent spectra of rhodamin B and ARB.

如图4，修饰后琼脂糖的荧光特性与罗丹明B基本相同，激发波长都在560 nm左右，发射波长都为580 nm。所以修饰后琼脂糖中的罗丹明B性质并未发生改变[32-33]。因此，在以后的检测中可以按照罗丹明B的标准，增加了使用的方便性。

2.5 荧光微球的形态学观察

修饰后琼脂糖荧光微球的形态学观察可以利用多种技术(见图5)。采用光学显微镜(200×)(见图5a)，可以清晰观察到微球，由于其为冷凝固化，琼脂糖的表面不是规则的平滑；罗丹明B修饰的琼脂糖微球的内部较单纯琼脂糖微球更加致密。图5b为在同一视野中采用荧光显微镜观察，采用绿光激发，发现荧光微球与罗丹明和修饰后琼脂糖一样，都产生红色荧光。通过扫描电子显微镜进一步观察微球的形态(见图5c)，发现微球具有较好的球形度，且未观察到明显及大量的损伤，这是因为微球有较好的机械性能，进行冻干处理的机械行为不会导致明显和巨大的损害。上述结果一致说明通过水水乳化制备的琼脂糖荧光微球具有良好球形的外部特征。在先前的研究中，水水乳化法被用于其他多种材料的微球制备[27-28,34]，同样是温和的条件，也可以制备出良好球形的微球。

(a.光学显微镜观察；b.同一视野中荧光显微镜观察；c.扫描电子显微镜观察。a.Under optical microscope;b.Under fluorescence micro scope;c.Under SEM.)

图5 微球的外部形态
Fig. 5 The morphology of the microparticles

相较于水油乳化，水水乳化法是一种较新的微球制备方法。所选用的材料无毒，无有机溶剂，制备条件温和，从而不会对包埋的生物活性大分子或细胞造成危害；所得凝胶微球圆整度较好，表面光滑，微球粒径较为均一。

2.6 微球粒径分析

通过修饰后琼脂糖微球的扫描电镜照片以及粒度分析，可以进行微球的粒度分散分析。如图6所示，按照条件制备的微球平均粒径为44 μm，在直方图中微球粒径分布有2个高峰，分别在5和70 μm左右，具有两个峰的现象是传统的乳化结果[35-36]。上述结果说明水水乳化和水油乳化方法制备的琼脂糖微球在物理性质方面具有很高的相似性。

图6 微球的粒径分布Fig. 6 The range of particle sizes of microparticles

2.7 荧光接枝稳定性

将修饰后荧光微球与单纯包埋罗丹明B的琼脂糖微球进行了比较(见图7)，发现单纯包埋的琼脂糖微球体系中微球的荧光强度在12 h内减少迅速，一直到60 h后基本平缓。加入越多的罗丹明B，整个体系的荧光强度越高，即初始荧光强度也越高。对于经过修饰后的琼脂糖荧光微球，只有荧光强度的微小变化，可以归结为随机波动，整体荧光强度没有变化。这个结果说明罗丹明B与琼脂糖接枝后连接紧密，表现为十分稳定的分子。并且在60 h内没有观察到溶液的变化，即没有罗丹明B的出现。于是制备荧光接枝稳定性的微球具有很大必要性，荧光稳定的微球在今后的研究中将具有更广泛的应用。

图7 荧光微球与单纯包埋罗丹明B的琼脂糖微球的荧光接枝稳定性Fig. 7 The time stability of fluorescent microparticles and simple RB embedded microparticles

3 结语

罗丹明修饰的琼脂糖可以通过环氧氯丙烷活化的方法实现。这个独特并且高效的方法可以将罗丹明B接枝到琼脂糖上，形成一种新的化合物。由于罗丹明B基团的存在，修饰后的琼脂糖具有了荧光特性，其荧光特性与罗丹明B基本相同。采用修饰后琼脂糖制备荧光微球，通过水水乳化法，可以使荧光特性得到长时间的保存。荧光微球在细胞标记，生物大分子标记中应用广泛。这种荧光微球可以应用于生物分子的标记与分析，或者作为示踪物，具有荧光强度高、光谱性质稳定等特性。