基于胶原-琼脂糖的组织工程表皮替代物构建研究

赵雅静，曹燕燕，2，申治中，菅傲群，桑胜波

(1.太原理工大学 a.信息与计算机学院 微纳系统研究中心，b.新型传感器与智能控制教育部和山西省重点实验室，太原 030024；2.河北北方学院 信息科学与工程学院，河北 张家口 075000)

皮肤是人体面积最大的器官，也是人体抵御外部刺激的第一道防线[1]。体外皮肤损伤(如烧伤、冻伤等)，各种皮肤病或其他疾病会导致皮肤大面积损伤，治疗需要大量的皮肤源[2-4]。此外，对于许多疾病的研究以及药物的药理试验、化学合成物的毒理试验都需要用到皮肤样品，尽管现在动物皮肤在一定程度上可以作为人体皮肤的替代品，但与人体皮肤仍存在差异[5-7]。基于对皮肤的大量需求和伦理等各方面的考虑，开发用于皮肤再生的组织工程具有很大的科学研究和临床价值[8-9]。

表皮作为人体皮肤的最外层结构，能有效地防止有害物质入侵人体[10]。因此，人们对体外表皮替代物从生物材料、种子细胞等方面进行了大量的研究。在20世纪70年代，有研究者通过对表皮细胞直接进行培养用于创伤治疗，但这种方法耗时长、创面接受率低，不利于伤口愈合[11]。因而，人们开始用天然的生物材料与细胞结合进行体外表皮替代物的构建。HORCH et al[12]将角质形成细胞接种在胶原膜上形成单层表皮替代物，但无法在体外维持较长时间。之后，人们相继使用壳聚糖、明胶、琼脂糖等生物材料构建表皮替代物，但其生物相容性均低于胶原。因此，选用复合型生物材料更有利于表皮替代物的构建[13]。

胶原是人体皮肤的主要组成成分，维持着人类皮肤的弹性和韧性，同时具有支撑和保护作用，而且主动参与细胞的迁移、分化和增殖代谢，具有良好的生物相容性[14]。在皮肤组织工程方面已经有了大量的应用与研究，但其存在降解速度较快，机械性能较弱的问题[15-16]。琼脂糖作为一种天然多糖材料，是一种高亲水性聚合物，具有细胞无毒性、降解缓慢、材料成本低等特点，成胶后具有良好的机械性能[17-18]。同时，人类永生化表皮(HaCaT)细胞作为体外表皮替代物研究的种子细胞与正常人表皮细胞特性相似，与正常人表皮细胞相比更容易进行繁殖，能更方便地用于实验研究[19-21]。因此，可以利用琼脂糖来提高胶原蛋白的机械性能，HaCaT细胞作为种子细胞来构建一种理想的组织工程表皮替代物。

本研究将制备胶原-琼脂糖的复合水凝胶作为人类永生化表皮(HaCaT)细胞的体外三维生长环境，并对制备的胶原-琼脂糖复合水凝胶进行体外表征，研究其形貌、理化性能和机械性能，并对HaCaT细胞在其上的生长状况进行测试。

1 实验

1.1 样品制备

将4 mg/mL的鼠尾Ⅰ型胶原蛋白(collagen from rat tail，Type Ⅰ)酸性溶液在冰上用中和液(0.1 mol/L的NaOH溶液)中和至中性并稀释至2 mg/mL，在4 ℃条件下保存备用。琼脂糖(麦克林，上海)溶于95 ℃的去离子水中制得质量分数为2%的澄清透明溶液，使其在室温下温度降至37 ℃，此时将准备好的胶原蛋白溶液和琼脂糖溶液按不同比例进行混合(两者混合后的比例见表1)，混合后的溶液在室温下静置凝固，制得胶原-琼脂糖复合水凝胶。

表1 胶原和琼脂糖的混合比例Table 1 Ratio of collagen to agarose %

1.2 胶原-琼脂糖复合水凝胶的性能测试

1.2.1溶胀率的测试

将胶原-琼脂糖复合水凝胶支架浸入37 ℃的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)中，24 h后擦干表面多余的水分，测定此时支架的湿重W1，根据公式(1)计算出支架的溶胀率。

Ws=[(W1-W0)/W0]×100% .

(1)

其中，W0为支架浸泡之前的重量[22]。

1.2.2密度的测试

测量胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的重量(W)、半径(R)和高度(H)，根据公式(2)来计算支架的密度[23]。

(2)

1.2.3降解率的测试

将胶原-琼脂糖复合水凝胶支架置于PBS溶液中，放置在37 ℃下，不搅拌。每隔一段时间取出样品，烘干后称量，同时用新鲜PBS代替原来的PBS溶液。根据公式(3)计算支架的降解率。

Dd=((WI-WF)/WI)×100% .

(3)

式中：Dd是降解程度；WI是样品初始干重；WF是最后的样品干重。

1.2.4机械性能的测试

通过机械试验机测定胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的弹性模量，在室温下，以0.5 mm/min的恒定变形速率压缩样品。采用变形5%～20%时的应力-应变曲线的斜率来计算弹性模量，结果为7个胶原-琼脂糖复合水凝胶样品的平均值。

1.2.5支架形貌分析

在12～15 kV加速电压下，用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)分析胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的形貌。在扫描电镜观察之前将胶原-琼脂糖复合水凝胶支架冷冻干燥并进行喷金。

1.2.6活/死细胞实验

将制备好的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架用细胞培养液(Gibco高糖培养基DMEM加体积分数10%的胎牛血清和1%的青霉素-链霉素溶液)浸泡2 h，同时用紫外光照射进行灭菌。得到无菌的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架后，将培养至第三代的HaCaT细胞(购自广州优泽生物技术有限公司)以1×105cm-2的密度接种在胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的表面，置于培养箱中，3 d后进行活/死细胞染色。先将胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上的细胞用PBS洗涤两次，加入活细胞染色试剂(Calcein-AM)染色0.5 h，然后将活细胞试剂吸出后加入死细胞染色试剂(PI)染色3 min，染色完成后对细胞用PBS进行清洗，置于荧光显微镜下观察。

1.2.7细胞骨架实验

对接种到支架上的细胞进行鬼笔环肽(Phalliodin)染色，观察细胞的骨架。与活/死细胞实验接种细胞过程相同，细胞在胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上培养3 d后进行鬼笔环肽染色。将支架上的细胞用PBS清洗后加体积分数4%的多聚甲醛固定20 min，然后在避光条件下加入染色试剂，室温下孵育30 min，用PBS清洗后加入DAPI试剂避光孵育10 min，最后用PBS清洗干净，置于荧光显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架形貌分析

为观察胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的形貌，对制备的支架冷冻干燥后进行了扫描电子显微镜测试，观察了胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的表面和内部(图1).图1中胶原-琼脂糖复合水凝胶支架干燥后表面是完整的结构，为细胞的生长提供支撑。冷冻干燥后的胶原-琼脂糖复合水凝胶内部呈现多孔形态，表明胶原-琼脂糖复合水凝胶的内部是多孔结构，能为细胞存储营养物质以及向外界传递细胞产生的代谢物，有利于细胞的生长。从SEM的整体结果来看，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架无论是其表面的完整结构还是内部的多孔结构都有利于HaCaT细胞在其上面的生长，有利于进一步进行表皮替代物的构建与研究。

图1 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架表面和内部SEM图Fig.1 SEM images of the surface and interior of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.2 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的理化性能分析

为研究胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的理化性能，对支架进行了密度、溶胀率、降解率的测试(图2)。由图2(a)可以发现，琼脂糖的比例增大，支架的密度增大，这是因为质量浓度为2 mg/mL的胶原溶液密度小于质量分数为2%的琼脂糖溶液，将两种溶液以不同比例混合成胶后密度会有所差别。总体来看，不同比例的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的密度都在0.8～1 g/cm3之间，存在较小的差异。但随着琼脂糖比例的增大，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的水溶胀差异明显(图2(b)).琼脂糖比例为0时的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的溶胀率只有7%，而琼脂糖比例达50%时，支架溶胀率达48%.这种差异的产生是因为相比胶原而言，琼脂糖具有更强的吸水性，作为细胞支架能为细胞提供更多的水分。胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的降解速率直接影响着细胞可以在支架上生长的时间，图2(c)是胶原-琼脂糖复合水凝胶支架降解率的测试结果。随着时间的增加，不同比例的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架都有一定程度的降解，但琼脂糖占比越高，降解的速率越慢。在图2(c)中，含有琼脂糖的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架大约留有60%，而琼脂糖含量为0的支架只有不到35%.因而，含有琼脂糖的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的理化性能更好。

图中**表示P<0.01有显著的统计学差异图2 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的密度、溶胀率和降解率Fig.2 Density, swelling rate, and degradation rate of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.3 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的机械性能分析

为研究胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的机械性能，对不同比例的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架进行了弹性模量测试(图3).图3(a)为不同比例胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的应力-应变曲线图。可以发现，压缩量一定时，琼脂糖比例越高，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的应力越大。而且，与琼脂糖比例为0的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架相比，比例为20%的胶原-琼脂糖复合水凝胶是它的2倍；当胶原-琼脂糖复合水凝胶支架中琼脂糖的比例增大到50%时，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的应力是琼脂糖比例为0的13倍。由图3(b)可以发现，琼脂糖的比例越大，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的弹性模量越大，在琼脂糖的比例达到50%时，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的弹性模量明显增大。

图中**表示P<0.01有显著的统计学差异图3 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的应力-应变曲线和弹性模量Fig.3 Stress-strain curve and elasticity modulus of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.4 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的生物相容性分析

为了研究胶原-琼脂糖复合水凝胶支架的生物相容性，将细胞接种在支架上3 d后对细胞进行了活/死染色(图4)和鬼笔环肽染色(图5).由图4可以观察得到，随着琼脂糖比例的增大，支架上细胞密度无明显差异，这说明不同比例的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架都比较适合HaCaT细胞的生长。但从死细胞的图中观察发现琼脂糖比例越高，胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上的死细胞越多。对细胞活性而言，琼脂糖含量为0的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架最适合HaCaT细胞生长。如图5所示，对胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上的细胞进行了鬼笔环肽染色，图中绿色荧光代表细胞骨架，蓝色荧光代表细胞核。在图中可以观察到细胞呈方形，部分细胞有分化的趋势呈现出三角形，在不同比例的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上可以看到HaCaT细胞的分裂。图5中琼脂糖比例为0的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上的细胞密度最大，可以明显观察到细胞的重叠，HaCaT细胞的生长状况最好。从细胞的增殖分化来看，琼脂糖比例为0的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架最适合HaCaT细胞的生长。但对于体外表皮替代物的构建，支架在理化与机械方面性能的优劣也影响着表皮替代物的性能。琼脂糖比例为35%的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架相比含量为0的支架具有更好的机械性能，在图5中也表现出较好的生物相容性，因此，琼脂糖含量为35%的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架更适合作为表皮替代物。

图中绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞图4 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上细胞的活/死染色图Fig.4 Live/dead staining image of cells on collagen-agarose composite hydrogel scaffold

图中绿色荧光代表细胞骨架，蓝色荧光代表细胞核图5 胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上细胞的鬼笔环肽染色图Fig.5 Phalloidin staining image of cells on collagen-agarose composite hydrogel scaffold

3 结论

通过制备不同比例的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架，研究其形貌、理化性能、机械性能以及体外的生物相容性发现，当胶原-琼脂糖复合水凝胶支架中两者的含量分别为65%和35%时，支架具有良好的理化性能和机械性能。同时，HaCaT细胞在此比例下的胶原-琼脂糖复合水凝胶支架上可以进行良好的生长。因而，在胶原-琼脂糖复合水凝胶支架中两者的含量分别为65%和35%时，能够同时兼顾支架的机械性能和生物相容性，可以作为一种理想的组织工程表皮替代物。