联合T、B细胞表位设计多肽疫苗的研究进展①

李少华 唐 康 张春梅 金伯泉 马 樱

(第四军医大学基础部免疫学教研室，西安710032)

·专题综述·

联合T、B细胞表位设计多肽疫苗的研究进展①

李少华②唐 康 张春梅 金伯泉 马 樱

(第四军医大学基础部免疫学教研室，西安710032)

从Adam等[1]发现针对口蹄疫病毒的多肽疫苗，到Lerner[2]建立多肽疫苗合成的方法，再到联合T、B细胞表位多肽疫苗设计的出现，新型疫苗的研制快速发展。联合T、B细胞多肽表位是指将已证实或预测得到具有免疫原性的T、B细胞多肽表位通过生物、化学方法连接，或同时串联通用CD4+T细胞表位以增强T、B细胞表位的免疫原性，从而形成的人工合成多肽表位。由于单一表位免疫原性弱，而联合T、B细胞多肽表位可同时诱导体液免疫及细胞免疫应答，因此成为目前多肽疫苗研究的热点。国内外应用联合多肽表位设计疫苗在抗感染及抗肿瘤等方面已有诸多报道，本文将对联合多肽表位的选择、连接方式、疫苗的设计以及在疾病模型中的研究和应用等方面的进展进行全面综述。

1 T、B细胞表位及通用Th细胞表位

1.1 T、B细胞表位 T细胞表位是指能与MHC分子结合并被T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别从而激活特异性T淋巴细胞的一类多肽，分为CD4+T细胞表位和CD8+T细胞表位，前者一般为13～17个氨基酸的短肽，结合MHC Ⅱ 类分子，而后者一般为8～10个氨基酸的短肽，结合MHC Ⅰ 类分子。B细胞表位是指能被B淋巴细胞表面B细胞受体(B cell receptor， BCR)识别并能诱导其产生中和抗体的多肽，包括线性表位与构象表位。其中B细胞以识别构象表位为主，但由于技术的限制，目前人工筛选用于多肽疫苗的B细胞表位绝大部分为线性表位。

1.2 通用Th细胞表位 多肽疫苗具有特异性强、安全性高及容易保存等优点，但也因免疫原性较弱、半衰期较短以及MHC限制性等因素影响了其免疫效果。Sinigaglia等[3]在1988年报道了一种来源于恶性疟原虫的蛋白多肽且能够与多种人和鼠的MHCⅡ类分子结合从而激活多个克隆Th细胞的肽段，其序列为DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS，并将这类较为保守的肽段命名为通用Th细胞表位。之后科学家们又陆续发现了其他一些与通用Th细胞表位具有相似作用的多肽序列。1999年，美国联合生物医学公司根据通用Th细胞表位可作为多肽表位免疫刺激物的特性申请了专利。目前已应用于实验研究的主要通用Th表位有PADRE和破伤风类毒素与白喉类毒素等。

1.2.1 PADRE 1994年，Alexander等[4]通过引入适当的锚定残基合成了6条十三肽，亲和力分析以及一系列体内外实验证实合成的十三肽可具备不受MHCⅡ类分子，尤其是HLA-DR分子限制的能力，并且它们诱导T细胞应答的能力是天然表位的一千倍以上。由于该组肽段中有两条十三肽与HLA-DR、DQ亲和力非常高，因此他们将这些合成肽段命名为泛DR表位(Pan DR epitope，PADRE)，并且预测了PADRE将在新型多肽疫苗的研制中具有重要的应用前景。目前应用较多的是序列AKFVAAWTLKAAA。

1.2.2 破伤风类毒素与白喉类毒素 Diethelm-Okita等[5]在研究破伤风类毒素上T细胞表位时，发现其中两个表位肽能够激活预先建立的任意一组T细胞克隆，随后应用随机T细胞对破伤风类毒素来源的两个肽段以及白喉类毒素来源的7条肽段进行分析，发现这些肽段均具有相似的通用Th细胞表位功能，目前破伤风类毒素来源的两条肽段IDKISDVSTIVPYIGPALNI和NNFTVSFWLRVPKVSASHLET的应用最为广泛。另外，还有一些通用Th细胞表位应用于某些病毒感染性疾病疫苗的设计中，例如HIV联合表位肽疫苗设计中使用的pol711等[6]。

2 多肽抗原表位的连接方式

2.1 直接连接模式 直接将多个T细胞或B细胞表位首尾相连得到的串联多肽表位，多采用CTL表位的N端连接B细胞表位C端，B细胞表位N端再连接通用Th细胞表位C端，中间可以重复连接。各表位之间以柔性linker如3～5个甘氨酸连接以防止新的抗原表位形成。该连接方法可以有效增强抗原多肽表位的免疫原性，同时又可以做到对各个抗原表位的准确定量。但一般需要串联30～40个以上的氨基酸才会具有较好的免疫原性[7]。

2.2 多抗原肽模式 Tam等[8]在1988年报道了将多个表位连接于多聚赖氨酸骨架的分支上从而获得联合多肽表位的方法。该连接方法可以使表位在空间上充分展开，不需载体即可显著提高免疫原性，但合成费用较高，如Liao等[9]在研究来源于人端粒逆转录酶(hTERT)的表位肽连接时，将其中3个CTL表位分别连于赖氨酸骨架上，并在体外实验中证明其激发抗肿瘤免疫应答的效果较线性表位更强。

2.3 脂肽模式 通过将各T、B细胞表位共价连接于具有佐剂活性的脂质分子上从而构建获得多肽表位。脂质分子稳定且具有亲脂性，该方法可使联合表位获得亲脂性从而更容易进入细胞内，例如Wilkinson等[10]将脂质佐剂、人表皮生长因子2(HER-2)或黏蛋白1(MUC1)、PADRE以及肿瘤相关糖类抗原(TACA)串联在一起构建成为self-adjuvanting肿瘤糖肽疫苗，并在小鼠体内实验中证实该连接模式可优化表位的排列，使其更容易被树突状细胞加工提呈。

2.4 表位基因重组表达模式 将编码表位肽的核苷酸序列通过适当的方式串联起来，与细菌质粒重组后，通过真核表达系统表达出重组多肽表位。该方法中序列的串联需要保证每个编码表位的基因序列可被正确阅读、翻译和有效终止，同时也需要选择合适的表达载体和启动子。这种方式由于可以量产，也得到了广泛的应用，但步骤较多且需要进一步纯化[11]。

3 联合多肽表位在多种疾病疫苗设计中的研究与应用

3.1 在抗寄生虫疫苗设计中的应用 寄生虫多肽疫苗的研究绝大多数是针对刚地弓形虫与疟原虫的研究。联合T、B细胞表位的疫苗设计在抗疟原虫中已有研究，例如Powell等[12]应用恶性疟原虫蛋白上的T细胞表位、B细胞表位重复3次，与同源通用Th表位连接，末端再串联20个赖氨酸残基及一个酪氨酸残基组成的21肽，最终获得的肽段在以碳酸钙为核心的微粒表面形成薄膜展开，称之为layer-by-layer (LbL)微粒，用LbL免疫小鼠后测定中和抗体和特异性CTL，结果证实该肽段可诱导较强的免疫保护作用。El Bssati等[13]将组氨酸标签his-tag、CTL表位及多重卷曲肽段(包含PADRE)等连接在一起构成能够自我组装成颗粒的肽段，用于设计针对刚地弓形虫的多肽疫苗，在HLA-B*0702的转基因小鼠中证实该肽段激活CD8+T细胞应答的能力较强[13]。Mahajan等[14]在研究针对恶性疟原虫的多肽疫苗中，将疟原虫子孢子、红内期、红外期T、B细胞表位采用不同的大量重复串联方式构建成为3种多抗原肽(MAP-1、2、3)，并证明这3种多抗原肽在小鼠体内可不同程度抑制红内期疟原虫的生长。

3.2 在肿瘤疫苗设计中的研究 在新型肿瘤疫苗的研究中，联合多肽表位疫苗设计目前已有广泛应用，其中T、B细胞表位主要来源于肿瘤中人端粒逆转录酶hTERT、糖脂蛋白GLP、黏蛋白MUC以及HER-2分子等。PADRE等通用Th表位也应用于串联表位肿瘤多肽疫苗设计中，例如，Bettahi等[15]将来源于卵白蛋白的CTL表位、PADRE、糖类B细胞表位、棕榈酸(PAM)连接并搭载于GLP上构建针对小鼠B16黑素瘤的多肽疫苗OVA-GLP，在小鼠荷瘤模型中发现其可有效抑制肿瘤生长。随后用来源于HER-2的CTL表位替换卵白蛋白CTL表位，从而构建成为HER-GLP-1线性GLP疫苗，并将PAM连接在CTL表位和PADRE之间得到具有分支结构的HER-GLP-2疫苗分子，实验证实HER-GLP-1能更好地被树突状细胞提呈，并能刺激产生更高频率的IFN-γ及更强烈的CTL应答，而HER-GLP-2则能刺激B淋巴细胞产生更高水平的特异性IgG，该研究结果对制备针对乳腺癌的多肽疫苗及其临床治疗都具有重要意义[16]。Cai等[17]将来源于MUC1的B细胞表位与破伤风类毒素P2连接构建联合多肽表位，并与PAM连接，实验证实其在没有佐剂辅助的情况下也能刺激小鼠产生针对MUC1的特异性抗体。Nezafat等[18]构建了一种针对肾母细胞瘤(Wilms瘤)的新型联合表位肽疫苗，将软件预测获得的分别来源于Wilms瘤和人乳头瘤病毒(HPV) E7的两种CTL表位、PADRE和破伤风类毒素C段(TTFrC)连接，使用TLR4受体激动剂肝磷脂血凝素作为佐剂，促使CD4+T细胞向Th1转化，各肽段之间通过AAY及EAAAK等linker连接，通过对其3D结构进行分析，发现其表面可形成多个线性及构象B细胞表位，因此具备同时激活体液及细胞免疫应答的能力。Mahdavi等[19]将来源于HER-2的T、B细胞表位连接并通过GLSP linker再连接一个来源于麻疹病毒的通用Th细胞表位，从而构建得到针对乳腺癌的联合多肽表位，免疫小鼠后体内实验证实其诱导的免疫应答可有效抑制肿瘤细胞增殖。Wu等[20]将来源于人表皮生长因子受体(EGFR)的B细胞表位和来源于麻疹病毒的通用Th细胞表位编码序列重组表达得到MVF-EGFR的嵌合肽段，并证实其在小鼠体内可刺激产生针对EGFR的高滴度抗体。

尽管诸多研究已表明联合多肽表位在肿瘤多肽疫苗的研究中具有一定的应用前景，但目前大部分肿瘤多肽疫苗的设计还集中于CTL表位或B细胞表位串联通用表位的研究，三者串联构建联合多肽表位的应用还有待深入研究。

3.3 在抗病毒疫苗研究中的应用 应用重组表达病毒抗原联合多肽表位的方法，即通过选择病毒多肽抗原表位，获得其DNA序列，扩增后插入质粒，导入表达细菌得到目的肽段，如Kulkarni等[21]将分别来源于日本脑炎病毒(JEV)包膜蛋白和非结构蛋白1的5种表位按B1TH1、B2TH3、B1TH2、TH3B1的组合方式连接，表达后得到肽段P-JEV即为针对JEV的联合抗原表位。Li等[22]设计的针对JEV的多肽疫苗则包含PADRE，并且在肽段N端连接纤维蛋白溶酶原活化剂(TPA)以促进肽段的溶解、分泌与折叠，同时连接CpG基序以增强多肽表位的免疫原性，最终形成包括PADRE、两种T细胞表位以及4种B细胞表位的联合多肽表位疫苗，实验证实其在小鼠体内可诱导产生高滴度抗体与高水平T细胞应答。Wei等[23]将针对甲型H1N1猪流感病毒的T、B细胞表位各两个重组表达，并在两个B细胞表位之间通过KK作为linker，在两个T细胞表位之间通过RKR作为linker连接，在整个肽段的C端增加牛疱疹病毒1型的衣壳蛋白作为载体，实验证实在小鼠体内可有效激发体液与细胞免疫应答。Wang等[24]将6个B细胞表位、4个Th细胞表位以及两个CTL表位插入2型疱疹病毒的糖蛋白D中，将其中的某些非表位肽段替换，应用重组方法得到针对2型疱疹病毒的联合多肽表位肽段，免疫小鼠后证实其诱导的免疫应答可降低感染率或减轻感染症状。

将病毒抗原的各T、B细胞表位直接连接获得联合表位多肽作为候选疫苗分子进行免疫，也可诱导高水平的T细胞应答及抗体产生。Monso等[25]设计的针对口蹄疫病毒(FMDV)的联合多肽表位，先将四个B细胞表位并联于T细胞表位形成B4T肽段，发现B4T诱导CD1小鼠产生中和抗体能力较强。随后直接将两个B细胞表位连接于三肽KKK再连接通用Th细胞表位即B2T，发现B2T诱导免疫应答的能力更强[26]。Kashi等[6]则是直接在病毒蛋白的适当位置插入通用Th表位，如在HIV-1的反式激活蛋白(Tat)中富含Cys的结构域和碱性结构域中插入PADRE或Pol711，该方法既降低了Tat激活HIV基因转录的作用，也增强了其本身的免疫原性，免疫小鼠后证实Th1、Th2以及B细胞的免疫应答均有所增强[6]。

3.4 在抗细菌多肽疫苗设计中的应用 Mohamud等[27]构建的重组卡介苗(rBCG)包括两个多肽，rBCG018和rBCG032，前者将三种来源于Ag85B的T细胞表位连于Mtb8.4上，后者将来源于ESAT-6、CFP-10、MTP40蛋白的B细胞表位连于rBCG018，对rBCG与BCG诱导免疫应答的能力进行比较发现rBCG诱导细胞免疫及体液免疫应答的能力均强于BCG。Farjaha等[28]利用软件预测得到来自铜绿假单胞菌的多肽序列，证实其既包含B细胞表位又包含T细胞表位，将藻朊酸盐连接于该肽段，在小鼠肺炎模型中发现，用该肽段免疫后的小鼠发生急性肺炎的比例明显下降。Lin等[29]将预测得到的钩端螺旋体外膜蛋白OmpL1和LipL41的四个T、B细胞表位重组连接，免疫小鼠后发现CD4+T细胞，尤其是Th1细胞的应答显著增强。

需要注意的是，并非所有T、B细胞表位均可作为多肽疫苗设计的候选表位，例如在阿尔茨海默症的研究中发现，针对Aβ的抗体有一定疗效，而自身T细胞表位诱导的免疫应答则会引起不可逆的免疫病理损伤，因此在设计多肽疫苗时，可选用B细胞表位而不能选择自身T细胞表位。这种情况下可采用B+T*表位方式，比如Ramirez-Gualito等[30]将来源于Tau蛋白的针对阿尔茨海默病的B细胞表位和来源于结核分枝杆菌Ag85B的T细胞表位用四肽GPSL连接起来形成β转角得到28肽，实验证实该连接方法对各表位的免疫原性影响很弱。在设计针对登革病毒的多肽疫苗时，必须考虑到其特异性的抗体增强作用会导致巨噬细胞的感染加重，因此设计多肽疫苗时应避免选择其B细胞表位[31]，另外，在分析联合多肽表位的免疫原性时，一般将单个T、B细胞表位作为对照，或者将T+T*表位、B+T*表位作为对照，评价T+B+T*表位诱导免疫应答的效果。

4 结语

虽然针对联合T、B细胞表位多肽疫苗设计的研究已取得一定的进展，但各种疾病抗原的多肽表位设计方法较为独立，联合T、B细胞表位多肽疫苗的设计研究尚缺乏较为实用的规律和标准。例如表位如何优化选择，多肽表位之间如何优化连接等问题都有待进一步解决。同时，多肽疫苗的研制还有赖于抗原表位基本研究的进步，如优势T、B细胞表位的鉴定，更加有效的通用Th细胞表位的筛选以及合适的佐剂与运载体的应用等，均需要更深入的研究与探讨。

[1] Adam KH,Kaaden OR,Strohmaier K.Isolation of immunizing cyanogen bromide-peptides of foot-and-mouth disease virus[J].Biochem Biophys Res Commun,1978,84(3):677-683.

[2] Lerner RA,Green N,Alexander H,etal.Chemically synthesized peptides predicted from the nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome elicit antibodies reactive with the native envelope protein of Dane particles[J].Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(6):3403-3407.

[3] Sinigaglia F,Guttinger M,Kilgus J,etal.A malaria T-cell epitope recognized in association with most mouse and human MHC class II molecules[J].Nature,1988,336(6201):778-780.

[4] Alexander J,Sidney J,Southwood S,etal.Development of high potency universal DR-restricted helper epitopes by modification of high affinity DR-blocking peptides[J].Immunity,1994,1(9):751-761.

[5] Diethelm-Okita BM,Okita DK,Banaszak L,etal.Universal epitopes for human CD4+cells on tetanus and diphtheria toxins[J].J Infect Dis,2000,181(3):1001-1009.

[6] Kashi VP,Jacob RA,Shamanna RA,etal.The grafting of universal T-helper epitopes enhances immunogenicity of HIV-1 Tat concurrently improving its safety profile[J].PLoS One,2014,9(12):e114155.

[7] Stewart-Tull DE.Immunopotentiating conjugates[J].Vaccine,1985,3(1):40-44.

[8] Tam JP.Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system[J].Proc Natl Acad Sci USA,1988,85(15):5409-5413.

[9] Liao ZL,Tang XD,Lu MH,etal.Antitumor effect of new multiple antigen peptide based on HLA-A0201-restricted CTL epitopes of human telomerase reverse transcriptase (hTERT)[J].Cancer Sci,2012,103(11):1920-1928.

[10] Wilkinson BL,Day S,Malins LR,etal.Self-adjuvanting multicomponent cancer vaccine candidates combining per-glycosylated MUC1 glycopeptides and the Toll-like receptor 2 agonist Pam3CysSer[J].Angew Chem Int Ed Engl,2011,50(7):1635-1639.

[11] Valenzuela P,Medina A,Rutter WJ,etal.Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast[J].Nature,1982,298(5872):347-350.

[12] Powell TJ,Tang J,Derome ME,etal.Plasmodium falciparum synthetic LbL microparticle vaccine elicits protective neutralizing antibody and parasite-specific cellular immune responses[J].Vaccine,2013,31(15):1898-1904.

[13] El Bissati K,Zhou Y,Dasgupta D,etal.Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice[J].Vaccine,2014,32(26):3243-3248.

[14] Mahajan B,Berzofsky JA,Boykins RA,etal.Multiple antigen peptide vaccines against Plasmodium falciparum malaria[J].Infect Immun,2010,78(11):4613-4624.

[15] Bettahi I,Dasgupta G,Renaudet O,etal.Antitumor activity of a self-adjuvanting glyco-lipopeptide vaccine bearing B cell,CD4+and CD8+T cell epitopes[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(2):187-200.

[16] Renaudet O,Dasgupta G,Bettahi I,etal.Linear and branched glyco-lipopeptide vaccines follow distinct cross-presentation pathways and generate different magnitudes of antitumor immunity[J].PLoS One,2010,5(6):e11216.

[17] Cai H,Sun ZY,Huang ZH,etal.Fully synthetic self-adjuvanting thioether-conjugated glycopeptide-lipopeptide antitumor vaccines for the induction of complement-dependent cytotoxicity against tumor cells[J].Chemistry,2013,19(6):1962-1970.

[18] Nezafat N,Ghasemi Y,Javadi G,etal.A novel multi-epitope peptide vaccine against cancer: an in silico approach[J].J Theor Biol,2014,349:121-134.

[19] Mahdavi M,Keyhanfar M,Jafarian A,etal.Immunization with a novel chimeric peptide representing B and T cell epitopes from HER2 extracellular domain (HER2 ECD) for breast cancer[J].Tumour Biol,2014,35(12):12049-12057.

[20] Wu M,Zhao L,Zhu L,etal.Expression and purification of chimeric peptide comprising EGFR B-cell epitope and measles virus fusion protein T-cell epitope in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif,2013,88(1):7-12.

[21] Kulkarni R,Sapkal G,Mahishi L,etal.Design and characterization of polytope construct with multiple B and TH epitopes of Japanese encephalitis virus[J].Virus Res,2012,166(1-2):77-86.

[22] Li P,Cao RB,Zheng QS,etal.Enhancement of humoral and cellular immunity in mice against Japanese encephalitis virus using a DNA prime-protein boost vaccine strategy[J].Vet J,2010,183(2):210-216.

[23] Wei H,Lenz SD,Thompson DH,etal.DNA-vaccine platform development against H1N1 subtype of swine influenza A viruses[J].Viral Immunol,2012,25(4):297-305.

[24] Wang X,Xie G,Liao J,etal.Design and evaluation of a multi-epitope assembly peptide (MEAP) against herpes simplex virus type 2 infection in BALB/c mice[J].Virol J,2011,8:232-241.

[25] Monso M,de la Torre BG,Blanco E,etal.Influence of conjugation chemistry and B epitope orientation on the immune response of branched peptide antigens[J].Bioconjug Chem,2013,24(4):578-585.

[26] Blanco E,Cubillos C,Moreno N,etal.B epitope multiplicity and B/T epitope orientation influence immunogenicity of foot-and-mouth disease peptide vaccines[J].Clin Dev Immunol,2013,2013:475960.

[27] Mohamud R,Azlan M,Yero D,etal.Immunogenicity of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin clones expressing T and B cell epitopes of Mycobacterium tuberculosis antigens[J].BMC Immunol,2013,14(Suppl 1):S5.

[28] Farjaha A,Owlia P,Siadat SD,etal.Conjugation of alginate to a synthetic peptide containing T- and B-cell epitopes as an induction for protective immunity against Pseudomonas aeruginosa[J].J Biotechnol,2014,192(Pt A):240-247.

[29] Lin X,Sun A,Ruan P,etal.Characterization of conserved combined T and B cell epitopes in Leptospira interrogans major outer membrane proteins OmpL1 and LipL41[J].BMC Microbiol,2011,11(1):21-29.

[30] Ramirez-Gualito K,Richter M,Matzapetakis M,etal.Structural characterization by NMR of a double phosphorylated chimeric peptide vaccine for treatment of Alzheimer's disease[J].Molecules,2013,18(5):4929-4941.

[31] Usme-Ciro JA,Mendez JA,Laiton KD,etal.The relevance of dengue virus genotypes surveillance at country level before vaccine approval[J].Hum Vaccin Immunother,2014,10(9):2674-2678.

[收稿2016-01-28 修回2016-03-05]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.029

①本文受国家自然科学基金青年科学基金项目(81401297)、陕西省自然科学基础研究计划青年人才项目(2015JQ8295)资助。

李少华(1996年-)，男，主要从事抗感染免疫研究，E-mail:330321697@qq.com。

及指导教师：马 樱(1984年-)，女，博士，讲师，主要从事抗感染免疫研究，E-mail：merry_bg20@163.com。

R392.3

A

1000-484X(2017)01-0136-04

②第四军医大学学员旅五营十七连，西安710032。