犬胰岛细胞分离纯化实验研究

贺长军

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1 动物的选择:选用成年犬22只,体重约20～30 kg,雌雄不限,由哈尔滨医科大学第一临床医学院动物实验外科提供。

1.1.2主要试剂:Ficoll胰腺灌注液(HC-A),胶原酶V,胎牛血清(FBS),二苯硫卡巴腙(DTZ),吖啶橙(Acridine Orange,AO),碘化丙啶(Propidium Iodide,PI),分散酶Liberase RPMI,稀释溶液M199,冲洗溶液CMRL,终冲洗液/培养基,人血白蛋白,DNase I酶,HEPES,HBSS,胰岛素放射免疫试剂盒。1.2实验方法

1.2.1 犬胰腺的获取以及运输:在全麻下剖腹,打开腹腔,在胰腺周围撒入冰屑,于肾动脉开口下方之腹主动脉上系两跟细线,远端结扎,在近端侧用剪刀剪一小口,插入灌注管,在膈肌上方将胸主动脉结扎,用冷的HC-A快速灌注,用量约为1 500毫升,同时打开下腔静脉,排出血液。观察腹腔各器官,当颜色呈均匀灰白色,静脉流出液清亮而不带血色时,表示灌注成功。待胰腺灌注完成后,连同十二指肠一并将胰腺切下,放入周围有冰屑的胰腺容器中,运回实验室。

1.2.2 犬胰腺的初剪以及灌注:在超净台内将胰腺从无菌的胰腺容器中取出,抽取2毫升保存液进行微生物检测。放入预先倒入Hanks平衡液的初剪盘上,初剪盘置于冰屑上。

切除十二指肠及较多脂肪和筋膜组织,进行初剪。同时注意胰腺的大小,有无损伤,灌注的效果如何。第1个烧杯中倒入10% betadine溶液,第2个倒入二性霉素B溶液,第3个倒入冷的HBSS液各500ml。将修剪的胰腺放入第1个烧杯,清洗并控出多余液体,然后浸入第2个烧杯,最后在第3个烧杯中清洗。将胰腺放入称重瓶中进行称重并计数,移入另一超净台中进行灌注。

在制冷的循环剪切盘上进行灌注,冷循环剪切盘中加入冷的Euro Collins (100 ml)。在胆总管附近胰头后方找到主副胰管,插入套管针,缝扎系紧固定,经套管打入UW液少许,使主副胰管膨胀,从而证实犬胰腺两叶插管成功。抽取2毫升液Euro Collins进行生物学检测 。

将插管的胰腺放在灌注罐的筛网上,连接外部管线到前面的端口。将liberase胶原酶溶液倒入灌注盘中,排除管线中的空气。用4 ℃的liberase胶原酶循环灌注,依靠蠕动泵的转速来调节胶原酶的灌注压力。在80毫米汞柱灌注压力下维持5分钟,在180毫米灌注压力下维持5分钟,灌注同时修剪胰腺,剔除包膜。如果有渗漏应予钳夹,保持灌注压力的的恒定,将灌注好的胰腺放入肾盘中,回收胶原酶,并将胰腺剪成数个2～3厘米的小块,移入另一超净台的Ricordi chamber(震荡室)中进行消化。同时抽取1毫升胶原酶进行生物学检测。

1.2.3 犬胰腺的消化:在进行消化之前,将剪碎的胰腺连同收集剩余的胶原酶溶液一起加入到震荡室内,封闭系统,进行循环,排除气泡。在消化8～10分钟时开始,每隔2～3分钟抽取样品1 ml,并加入2～3 ml DTZ。记录观察结果直到游离胰岛可见。当样品中可见50%游离胰岛以及较多细小组织碎片时,开始加入稀释液以终止酶的消化过程。将泵的速度调至300 ml/min。继续加入稀释液8 L。收集消化的组织放于250 ml冷循环锥形试管架中的锥形试管中。每个试管加入人血清15 ml,加入85 ml MEM于前6个试管中,当试管加满后,立即放于冰屑中保存以快速冷却。在4 ℃下将锥形离心管以1 000 rpm离心1分钟。将上清夜中表层200 ml吸出,然后加入冷的M199洗液将胰岛沉淀重新悬浮。然后重复上述过程,直到所有消化下来的组织全部收集于1～2个250 ml离心瓶中。在纯化前从250 ml含M199的离心瓶中抽取100 μl样品用于生物学检测。将离心瓶于1 000 rpm下离心,然后尽量去除沉淀表面的上清液,重复3次。计算细胞沉淀的体积和重量,然后将细胞沉淀重新悬浮于100 ml UW液中。然后在COBE 2991机器中用Ficoll纯化梯度纯化样品。

1.2.4 犬胰岛的纯化:将Ficoll(1.100,130 mL)倒入第1个烧杯,将蠕动泵速调至最大(50 mL/min)使其快速进入COBE。当所有Ficoll进入COBE时,关闭蠕动泵,重新夹闭管线,并连接到泵上,将Ficoll(1.100,130 ml)倒入前一个烧杯。打开两个烧杯之间的夹子以使足够的Ficoll流入到两杯连线之间,重新夹闭。将Ficoll(1.077,140 ml) 倒入第2个烧杯中,彻底打开两个烧杯之间的夹子磁力搅拌器让两种Ficoll液相混合。当所有Ficoll液将要全部流入管线时,倾斜烧杯,并加入100 ml UW/胰岛制剂,最后加入M199(50 ml)以冲洗UW/胰岛制剂。当所有冲洗液经过管线进入COBE时,关闭蠕动泵,然后缓慢打开夹子以释放COBE内的压力,计时5分钟。

收集时将其分别收集到6个试管中,第1试管主要是胰腺组织,第2个试管为胰腺组织和少量的胰岛,第3、4个试管内为胰岛细胞,第5、6个试管内为废弃物。从每一个试管中取出1 ml加入到标记的六孔板中(×2),并加入二苯硫卡巴腙2～3 mL。记录纯度。

2结果

我们共进行了22例犬胰岛的分离和纯化的研究,热缺血时间为(5±2)分钟,冷缺血时间为(3±0.5)小时。犬胰腺的重量为(32.3±10.3)克,胰腺的插管后灌注时间为(10±3)分钟,消化时间为(25±6)分钟,消化前胰岛计数平均为(155 040±310)IEQ/胰腺,纯化后的胰岛平均计数为(74 200±185)IEQ/胰腺。本实验所有数据用均数±标准差表示,显著性检验采用2样本均数差别的t检验。

3讨论

糖尿病是常见的内分泌代谢性疾病,严重危害人们身心健康。胰岛移植是临床替代外源性胰岛素治疗1型糖尿病最有效的方法。研究证明,胰岛移植不仅能纠正糖尿病患者的糖代谢异常,更重要的是可以防治糖尿病微血管病变的发生发展,但胰岛移植发展必然要经历实验研究和临床实践两个阶段,在胰岛移植中,如何获得足够数量、具有高纯度和活性的胰岛细胞是一个重要而复杂的环节,其成败直接关系到所分离纯化的胰岛细胞可否用于临床及移植后能否纠正糖尿病。我们连续在实验室内分离和纯化了22例犬胰腺,使分离和纯化出来的胰岛细胞无论在数量上还是在质量上都能够满足临床移植的需要。

(收稿日期2009-11-01)