非生物胁迫下黄缨菊实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

摘要：为了筛选基因分析中黄缨菊（Xanthopappus subacaulis）稳定表达的内参基因，本研究以冷、盐和干旱胁迫下黄缨菊的根、茎和叶为材料，依据三代转录组数据选取8个常用内参基因（18S rRNA，GAPDH，PAL，UBQ，TIP，RPS，SAND，TUA）作为候选基因，利用qRT-PCR技术并结合geNorm，NormFinder，BestKeeper和RefFinder软件综合评价候选内参基因的表达稳定性。结果表明，冷胁迫下黄缨菊根、茎、叶中最佳稳定性的内参基因分别为SAND，TIP和GAPDH；干旱胁迫下最稳定的内参基因分别是SAND，TUA和UBQ；盐胁迫下稳定性最好的内参基因分别为RPS，RPS和SAND。此外，分别以干旱胁迫处理下黄缨菊根、茎、叶中2个稳定性最佳和1个稳定性最差的基因作为内参基因，衡量耐逆基因WRKY表达量的准确性，表明不同胁迫下筛选出的黄缨菊不同组织中内参基因的稳定性结果均是可靠的。研究结果为今后黄缨菊耐逆基因的表达分析提供了基因资源和理论依据。

关键词：黄缨菊；内参基因；实时荧光定量PCR；非生物胁迫；表达稳定性

中图分类号：Q344+.13""" 文献标识码：A""""" 文章编号：1007-0435（2024）07-2028-11

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.004

引用格式：

余明君， 苏丹丹， 苏" 旭，等.非生物胁迫下黄缨菊实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证［J］.草地学报，2024，32（7）：2028-2038

YU Ming-jun， SU Dan-dan， SU Xu，et al.Screening and Validation of Reference Genes for Xanthopappus subacaulis by Real-time Quantitative PCR under Abiotic Stress［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2028-2038

收稿日期：2023-11-24；修回日期：2024-03-26

基金项目：第二次青藏高原综合科学考察研究项目（2019QZKK0502）；青海理工大学（筹）“昆仑英才”人才引进科研项目（2023-QLGKLYCZX-012）资助

作者简介：

余明君（2001-），女，汉族，山西朔州人，硕士研究生，主要从事高山植物遗传多样性与分子进化研究，E-mail：15234934641@139.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：lyp8527970@126.com

Screening and Validation of Reference Genes for Xanthopappus subacaulis

by Real-time Quantitative PCR under Abiotic Stress

YU Ming-jun1，2， SU Dan-dan1，2， SU Xu1，2，3， CHEN Jin-yuan1，2，

LIU Yu-ping1，2*， ZHANG Yu1，2， LIU Tao4， YANG Qian1，2， NIU Fu-ying1

（1. School of Life Sciences， Qinghai Normal University， Xining， Qinghai Province 810008， China; 2. Key Laboratory of

Biodiversity Formation Mechanism and Comprehensive Utilization of the Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai Province， Qinghai

Normal University， Xining， Qinghai Province 810008， China; 3. Academy of Plateau Science and Sustainability， Qinghai Normal

University， Xining， Qinghai Province 810016， China; 4. School of Ecology and Environmental Science， Qinghai University of

Science and Technology， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：To screen the steadily expressed reference genes in the gene analysis，we analyzed the reference genes that were stable expression in Xanthopappus subacaulis. We used the root，stem and leaf of Xanthopappus subacaulis as experimental materials under different abiotic stressed，and screened eight candidate internal reference genes based on the full-length transcript sequencing. Meanwhile，we utilized qRT-PCR technology and combined geNorm，NormFinder，BestKeeper，and RefFinder software to comprehensively evaluate the expression stability of candidate reference genes. The results showed that SAND，TIP and GAPDH were the most stable reference genes in root，stem and leaf of X. subacaulis under cold stress，respectively. SAND，TUA and UBQ were the most stable in roots，stems and leaves under drought stress，respectively. RPS，RPS and SAND were the most stable in roots，stems and leaves under salt stress. In addition，we chose two genes with the best stability and one gene with the worst stability in the roots，stems and leaves as internal reference genes under drought treatment to evaluate the accuracy of expression level of the stress-tolerant gene WRKY，the results indicated that the stability of internal reference genes in different tissues of X. subacaulis were reliable under different stresses. The study provides the gene resources and theoretical basis for the expression analysis of stress-tolerant genes of X. subacaulis in the future.

Key words：Xanthopappus subacaulis;Reference gene;qRT-PCR;Abiotic stress;Expression stability

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种用来定量mRNA表达水平的方法，其将优化后的荧光染料加入到qRT-PCR反应体系中，与核酸分子结合发出荧光信号，利用荧光信号强弱监测整个反应过程［1］。实时荧光定量PCR因具有检测速度快、高效、数据准确等优点，现已被广泛应用于植物基因的表达分析［2-5］。qRT-PCR能够快速检测特定基因的表达变化，尤其可同时对两个不同目的基因的产量、反转录效率等进行差异比较，从而获得目的基因的表达差异，因而被认为是直接检测mRNA丰度最有效的方法［6］。同时，采用qRT-PCR技术检测目的基因的表达模式时，通常必须先选择一个稳定表达的内参基因进行校正和标准化［7］。内参基因（reference genes）即管家基因，是一类能在不同物种的所有细胞中均能稳定表达的基因，常被用作基因表达的参照物［1］。然而，内参基因的表达量因物种、组织、细胞、发育阶段或逆境胁迫的改变而改变，有时表达偏差高达百倍，因而检测某一基因的表达量时，若盲目将先前报道的管家基因作为内参基因，可能检测不到目的基因表达的微小变化，甚至可能错误或得到相反的结论［8］。因此，选择合适的内参基因对qRT-PCR检测目的基因的准确性至关重要。

黄缨菊（Xanthopappus subacaulis）是青藏高原东部地区一种特有的多年生草本植物，隶属于菊科（Asteraceae）、黄缨菊属（Xanthopappus），通常生长于海拔2 230～4 150 m的干旱草甸、草原及干燥山坡，主要分布在我国云南西北部、四川北部与西部、青海西部以及甘肃东南部［9-11］。黄缨菊具有较强的耐寒、耐旱及耐盐碱等特性，对维持青藏高原生态系统的稳定性具有重要作用［12］；同时，黄缨菊全草入药，对吐血、子宫出血、食物中毒及过敏性紫癜疗效显著，具有较高的药用价值［13］。目前，国内外有关黄缨菊的研究主要集中于化学成分［14］、药理活性［13］、耐逆生理［12］及群体动态历史［15-17］等领域，然而对其耐逆基因表达的研究未见报道，因此，筛选黄缨菊内参基因以及耐逆基因的表达研究十分重要。据此，本研究基于黄缨菊三代转录组数据，选取8个常用的内参基因，包括18S核糖体RNA基因（18S ribosome RNA，18S rRNA）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、苯丙氨酸解氨酶基因（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、多聚泛素酶基因（polyubiquitin，UBQ）、液泡膜内在水通道蛋白基因（tissue-preferentially expressed，TIP）、核糖体蛋白基因（ribosomal proteins，RPS）、SAND家族蛋白基因（SAND family protein，SAND）和α微管蛋白基因（α-tubulin，TUA）作为候选内参基因，利用qRT-PCR技术并结合geNorm，NormFinder，BestKeeper软件和在线工具RefFinder（https：//www.heartcure.com.au/reffinder/），分别对非生物胁迫下黄缨菊根、茎和叶中最稳定的内参基因进行筛选，旨在为黄缨菊耐逆基因的表达分析提供理论参考。

1" 材料与方法

1.1" 实验材料

黄缨菊成熟种子采自青海省共和县（36°29′25.14″N，100°47′38.64″E，海拔3 202 m），低温冷藏30 d后，挑选无虫害、籽粒饱满的种子，用10%的次氯酸钠浸泡消毒30 min，蒸馏水冲洗干净后置于铺有双层滤纸的培养皿中，待长出两片子叶后将幼苗种植于营养土与蛭石2∶1混匀填充的花盆中，随后将其置于26℃、相对湿度为60%的培养箱中培育。根据项目组前期的预实验结果，本研究均采用生长60 d长势一致的黄缨菊幼苗进行非生物胁迫处理，即4℃培养箱内冷胁迫，200 mL的20% PEG-6000高渗溶液浇灌幼苗模拟干旱胁迫，200 mL的200 mmol·L-1 NaCl溶液浇灌幼苗进行盐胁迫；胁迫处理0，3，6，12，24，48 h后，剪取黄缨菊不同组织（根、茎、叶）的样品，每个组织分别取3份样品置于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱备用。

1.2" RNA提取及cDNA合成

称取黄缨菊不同处理组的根、茎和叶各约100 mg，置于研钵中加入液氮将其研磨成粉末后，利用TaKaRa试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）进行RNA提取，提取的RNA用NanoDrop One和1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度和完整性，A260/A280值在1.8～2.1之间。吸取检测合格的1 μg RNA为模板，利用反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit）合成cDNA，置于-20℃冰箱保存备用。

1.3" 候选内参基因选择和引物设计

基于黄缨菊的三代转录组数据，挑选8条候选内参基因序列（18S rRNA，GAPDH，PAL，UBQ，TIP，RPS，SAND，TUA），根据荧光定量引物设计原则，利用Primer Premier 5.0软件设计黄缨菊的内参基因引物，要求退火温度介于55～61℃之间、引物长度为18～25 bp、扩增片段长度为100～300 bp；同时，利用Primer-BLAST（http：//ncbi.nlm.nih.gov./tools/primer-BLAST）对引物序列特异性进行分析。引物序列送至北京六合华大基因科技有限公司合成（表1）。

1.4" 引物特异性验证及qRT-PCR反应

合成引物利用PCR进行特异性分析，PCR反应体系为25 μL：2.5 μL缓冲液，2 μL dNTPs（dATP，dCTP，dGTP和dTTP混合物），待测cDNA样品2 μL，正反引物各1 μL（10 μmol·L-1），16.25 μL双蒸水，0.25 μL Taq PCR Master Mix；扩增反应程序：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，36个循环，72℃ 10 min，4℃保存，1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的质量和引物特异性。

qRT-PCR分析仪器为QuantStudioTM6，荧光试剂采购于宝日医生物技术（北京）有限公司的TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）。冰上配制反应体系为20 μL：TB Green 10 μL，ROX 0.4 μL，正反引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，模板cDNA（100 ng·μL-1）2 μL，ddH2O 6.8 μL；反应程序为：95℃预变形30 s，95℃变形5 s，58℃退火34 s，42个循环。引物扩增效率分析时，将上述cDNA（100 ng·μL-1）经5倍梯度稀释（5-1，5-2，5-3，5-4，5-5）制作标准曲线。每个样品均进行3次技术重复。此外，QuantStudioTM6自动获取各内参基因的扩增效率（E）和相关系数（R2）。

1.5" 候选内参基因稳定性分析

qRT-PCR反应结束后，利用QuantStudioTM6实时荧光定量PCR分析软件直接获取各内参基因的Ct值；采用Microsoft Excel 2016将各样品的Ct值整理，计算平均Ct值；运用geNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具分析各内参基因不同胁迫下的稳定性。其中，geNorm和NormFinder软件以2-△△Ct进行数据分析（△Ct=Ctmax-Ctmin），BestKeeper软件和RefFinder在线工具以样品的原始Ct值分析数据。geNorm软件通过各样品Ct值计算8个内参基因的表达稳定值（M）和配对变异值（Vn/n+1），M值越小，内参基因越稳定，当Vn/n+1lt;0.15时，最适内参基因的组合为n个［18-19］；NormFinder软件也是通过Ct值计算内参基因的表达稳定值，表达稳定值越小，内参基因越稳定［20］；BestKeeper软件利用Ct值计算各内参基因的标准偏差值（SD）和变异系数（SV），SD±SV值越小，基因越稳定［21］；RefFinder在线工具将geNorm、NormFinder和BestKeeper软件得到的内参基因稳定性进行综合排序，计算几何平均值，几何平均值越小，内参基因越稳定［22］。

1.6" 内参基因的验证

为了验证筛选出的所有内参基因的可靠性，本研究利用qRT-PCR技术并根据RefFinder综合分析得到的2个稳定性最佳和1个稳定性最差的内参基因，对干旱胁迫下黄缨菊耐逆基因WRKY的表达模式进行验证。qRT-PCR扩增中，WRKY基因所用的引物为：上游引物5′-TCATTCTTCTTCGCTCCTCT-3′，下游引物5′-CTCTTACGGCTCTACTTCCAG-3′。反应体系和程序同1.4，利用2-△△Ct法计算WRKY基因的相对表达量。

2" 结果与分析

2.1" RNA质量、内参基因特异性验证及扩增效率分析

采用超微量分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，结果显示黄缨菊的总RNA浓度为140～400 ng·μL-1，A260/A280值介于1.89～2.12之间；琼脂糖凝胶电泳表明18S和28S亚基条带清晰，无明显降解，说明获得的RNA纯度和质量较好，完全能够满足后续实验要求（图1）；qRT-PCR分析结果显示，8个候选内参基因的扩增产物均为单峰，表明内参基因引物特异性高，无引物二聚体（图2）。此外，每对内参基因引物的相关系数（R2）为0.978～0.999，扩增效率（E）介于92.643%～102.906%之间（表2），表明引物扩增效率良好，符合qRT-PCR分析要求。

2.2" 候选内参基因表达丰度分析

通过对8个候选内参基因qRT-PCR扩增，根据不同候选内参基因样品的循环阈值Ct值，本研究绘制了Ct值分布箱线图，所有候选内参基因的Ct值变化范围为17.164～39.525，说明黄缨菊不同内参基因的表达水平存在差异（图3）。其中，UBQ的Ct值最低，处于17.164～36.987之间；RPS的Ct值最高，介于22.132～39.525之间；各基因的表达丰度由高到低依次为UBQgt;PALgt;GAPDHgt;TUAgt;18S rRNAgt;TIPgt;SANDgt;RPS（图3）。

2.3" 候选内参基因稳定性分析

2.3.1" geNorm软件分析" 本研究利用geNorm软件分析了黄缨菊不同胁迫下内参基因的平均表达稳定值（M），结果显示冷胁迫处理下黄缨菊根、茎、叶中最稳定的内参基因分别是SAND与18S rRNA、SAND与18S rRNA，TIP与GAPDH；干旱胁迫下分别为TIP与18S rRNA，TIP与TUA，UBQ与TIP；盐胁迫下分别为TUA与RPS，TUA与SAND，SAND与TIP（图4）。此外，干旱胁迫下黄缨菊根、茎和叶中V2/3均小于0.15，表明TIP与18S rRNA，TIP与TUA，TIP与UBQ三套内参基因均分别能够足以满足黄缨菊qRT-PCR定量分析结果的可靠性，因而上述三套内参基因分别可以作为干旱胁迫下黄缨菊根、茎和叶的内参基因组合（图5）。冷胁迫和盐胁迫处理下筛选出的内参基因也能够作为黄缨菊根、茎、叶中的内参基因组合。

2.3.2" NormFinder软件分析" 利用NormFinder软件，本研究分析了黄缨菊8个候选内参基因的稳定性，发现冷胁迫下根、茎、叶中稳定性最高的内参基因分别为RPS（0.359）、TIP（0.738）和GAPDH（0.198），干旱胁迫下分别为SAND（0.164）、TUA（0.100）和UBQ（0.279），而盐胁迫下分别是RPS（0.373）、RPS（0.382）和18S rRNA（0.420）（图6）。

2.3.3" BestKeeper软件分析" 本研究利用BestKeeper软件计算了内参基因Ct值间配对的标准偏差（SD）和变异系数（CV），结果表明冷胁迫下黄缨菊根、茎、叶中稳定性最高的内参基因分别是TIP（7.88±1.96）、RPS（3.47±0.89）和TUA（4.08±1.04），干旱胁迫下分别为18S rRNA（4.02±1.03）、RPS（3.47±0.89）和SAND（1.92±0.52），盐胁迫下分别是18S rRNA（5.13±1.32）、RPS（5.18±1.31）和SAND（4.19±1.12）（表3）。

2.3.4" RefFinder分析" 为了获得更加合理的内参基因稳定性排序，本研究采用在线工具RefFinder对上述三种软件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）得到的结果进行综合排序，发现冷胁迫下黄缨菊根、茎、叶中内参基因稳定性排名前三的分别为SAND，RPS和18S rRNA，TIP，TUA和SAND，GAPDH，TIP和TUA；干旱胁迫下分别是SAND，18S rRNA和TIP，TUA，TIP和UBQ，UBQ，TIP和SAND；盐胁迫下分别为RPS，TUA和TIP，RPS，SAND和TUA及SAND，TIP和18S rRNA（图7）。

2.4" 内参基因的稳定性验证

为了进一步验证筛选出的内参基因稳定性，本研究以干旱胁迫下黄缨菊根中稳定性最佳的内参基因SAND、18S rRNA和稳定性最差的内参基因PAL，茎中稳定性最优的内参基因TUA、TIP和稳定性最差的内参基因SAND，叶中稳定性最好的内参基因UBQ、TIP和稳定性最差的内参基因PAL，来评估耐旱目的基因WRKY的表达模式。结果表明，以根中稳定性最佳的SAND和18S rRNA作为内参基因时，干旱胁迫处理0～3 h时WRKY基因的表达量随胁迫时间的增加而增加，3～12 h时表达量呈降低趋势，12～48 h时表达量则先升高后降低，而以根中稳定性较差的PAL为内参基因时，0～3 h时WRKY基因的表达量呈下降趋势，3～12 h时表达量先升高后降低，12～48 h时表达量则缓慢上升（图8A）；当以茎中稳定性最优的TUA和TIP为内参基因时，干旱胁迫处理0～3 h时WRKY基因的表达量呈上升趋势，以茎中稳定性最差的SAND为内参基因时，WRKY基因的表达量则呈下降趋势（图8B）；同样，当选取黄缨菊叶中最优内参基因UBQ和TIP为参照时，WRKY基因的表达量变化较为稳定，而以最差内参基因PAL为参照时，其表达量变化较为明显（图8C）。因此，不同胁迫下筛选出的黄缨菊不同组织中内参基因稳定性的排序相对准确和可靠。

3" 讨论

3.1" 内参基因在不同植物器官和处理条件下的稳定性有差异

内参基因通常是维持细胞基本生命活动的管家基因，所有细胞中均能稳定表达［23-25］。然而，内参基因的表达稳定性往往是相对的，即不同植物组织和不同处理条件下其稳定性均有差异。譬如，王浩等［26］采用实时荧光定量PCR筛选何首乌（Pleuropterus multiflorus）不同组织中稳定表达的内参基因，结果发现GAPDH基因表达稳定性最佳，SAND基因表达稳定性最差；韩晓雪等［27］通过对非生物胁迫下番茄（Solanum lycopersicum）内参基因表达稳定性的评价，发现番茄茎中SAND基因的表达最稳定，而根和叶中稳定性较差；赵晓冰等［28］利用实时荧光定量PCR技术通过对华细辛（Asarum sieboldii）6个常用内参基因表达稳定性的研究，结果表明叶中SAND基因具有最差的表达稳定性，而根中SAND基因的表达稳定性较好。以上研究均表明SAND基因具有明显的物种和组织特异性［26-28］。本研究结果显示，冷胁迫和干旱胁迫下黄缨菊根中SAND基因的表达稳定性最佳，而叶和茎中表达稳定性较差，这进一步验证了先前研究结果的正确性和合理性［26-28］。UBQ基因是一种多效的分子信号，通过靶蛋白泛素化修饰参与细胞内各种生物过程调控，在不同器官和组织中均能稳定表达［29-30］。例如，Bevitori等［31］研究发现UBQ5基因是水稻（Oryza sativa）接种稻瘟菌后表达稳定的基因；李苏涛等［32］通过评价巨菌草（Pennisetum giganteum）内参基因的表达稳定性，发现盐胁迫下根中UBQ基因的表达最稳定；代资举等［33］通过分析玉米（Zea mays）粗缩病诱导下内参基因的稳定性，发现UBQ基因是玉米粗缩病诱导下表达最稳定的基因。本研究结果同样表明，干旱胁迫下黄缨菊根和茎中内参基因UBQ的表达稳定性较好，而冷胁迫和盐胁迫下稳定性较差，认为内参基因的表达稳定性因植物组织和处理条件的不同而不同，因此筛选稳定表达的内参基因理应是分析目的基因表达模式的前提和基础。

3.2" 软件评估内参基因稳定性与实验验证相结合能得到可靠结果

geNorm、NormFinder和BestKeeper是评估内参基因稳定性最常用的三种软件。其中，geNorm软件通过分析比较不同样本中内参基因的稳定表达值M，确定最合适的内参基因［18］；NormFinder软件与geNorm软件运行原理相似，结合组内与组间方差计算内参基因的表达稳定值，但NormFinder软件只能选择一个基因为稳定内参基因，不能确定合适的内参基因组合［19］；BestKeeper软件通过对每个内参基因所有样本的Ct值进行相关分析，利用获得的变异系数（CV）和标准偏差（SD）综合评判内参基因的稳定性，但其仅能分析3～10个内参基因［20］。然而，三种软件因计算原则存在差异，故采用它们分别对同一样本分析时可能获得不同的结果。本研究结果显示，内参基因SAND和TUA是geNorm和NormFinder软件筛选出的冷胁迫根和干旱胁迫茎中最稳定的内参基因，而采用BestKeeper软件分析其表达稳定性时排名则为第4和第6；同样，盐胁迫下黄缨菊根中18S rRNA基因在BestKeeper软件中表达稳定性的排名第1，而在geNorm和NormFinder软件中排名均为第7。因此，geNorm和NormFinder软件对内参基因表达稳定性的评价结果较为接近，而其与BestKeeper软件获得的结果差异明显，这与徐圆圆等［34-36］的研究结论基本相似。为了获得3种软件对内参基因稳定性排序结果的准确评判，本研究还利用RefFinder在线工具对geNorm、NormFinder和BestKeeper的稳定性排序进行了综合评价，结果表明冷胁迫和干旱胁迫根中内参基因SAND的稳定性最佳，冷胁迫茎和盐胁迫叶中TIP基因最稳定。然而，采用分析软件筛选出的稳定表达的内参基因并不能完全确保结果的准确性，还需要利用目的基因对其可靠性进行进一步的验证，旨在获得更为可靠的研究结果［37-38］。据此，本研究选取RefFinder软件筛选出的干旱胁迫黄缨菊根、茎、叶中稳定性最佳的内参基因（SAND和18S rRNA、TUA和TIP、UBQ和TIP）以及最差的内参基因（PAL、SAND、PAL）为参照，分析黄缨菊耐旱基因WRKY的表达模式，结果发现当选取稳定性最优内参基因为参照时，WRKY基因的表达量变化较为稳定，而以最差内参基因为参照时，其表达量变化较为明显。因此，在评估内参基因稳定性时须将软件评估结果与实验验证相结合，旨在确保筛选获得的稳定表达内参基因的可靠性。

4" 结论

非生物胁迫下，黄缨菊筛选出的候选内参基因Ct值的变化范围是17.164～39.525；冷胁迫下黄缨菊根、茎、叶中稳定性最优的内参基因分别是SAND，TIP和GAPDH，干旱胁迫下稳定性最佳的内参基因分别为SAND，TUA和UBQ，盐胁迫下稳定性最好的内参基因依次为RPS，RPS和SAND；内参基因稳定性验证发现以黄缨菊根根、茎、叶中筛选出的稳定性最佳的基因为参照时，耐逆基因WRKY的表达量变化较为稳定，而以稳定性最差的基因为参照时，WRKY基因的表达量变化上下浮动变化较大。因此，不同胁迫下筛选出的黄缨菊不同组织中内参基因稳定性的排序较为准确和可靠。

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（责任编辑" 彭露茜）