不同添加剂对辣椒秸秆青贮品质及细菌多样性的影响

摘要：为探究不同添加剂对辣椒（Capsicum annuum L.）秸秆青贮品质和细菌群落结构的影响，试验以新鲜辣椒秸秆为原料，设置对照组（W0，添加等量无菌去离子水）、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）组（W1）、植物乳杆菌+纤维素酶（Lactiplantibacillus plantarum+cellulase）组（W2）、植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌（Lactiplantibacillus plantarum+Bacillus subtilis）组（W3）、植物乳杆菌+糖蜜（Lactiplantibacillus plantarum+molasses）组（W4）和纤维素酶（cellulase）组（W5），室温条件青贮60 d后测定其营养成分、发酵品质和细菌群落结构。结果表明：与W0组相比，添加剂处理组pH值、中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（Acid detergent lignin，ADF）均降低，乳酸（Lactic acid，LA）显著增加（Plt;0.05）；各添加剂处理组之间相比，W3组粗蛋白（Crude protein，CP）和LA高于其他组，pH值、NDF、ADF和氨态氮/总氮（NH3-N/TN）低于其他组。辣椒秸秆原料（WY）和W0组优势菌为蓝藻门（Cyanobacteriota）颤藻属（Oscillatoria），其他处理组优势菌为芽孢杆菌门（Bacillota）乳植物杆菌属（Lactiplantibacillus）。综上，添加剂能改善辣椒秸秆青贮品质，添加植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌的辣椒秸秆青贮品质最好。

关键词：辣椒秸秆；发酵品质；细菌群落结构；蓝藻门；芽孢杆菌门

中图分类号：S816.6""" 文献标识码：A""""" 文章编号：1007-0435（2024）07-2330-07

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.035

引用格式：

程志泽， 伊斯拉依·达吾提， 万江春，等.不同添加剂对辣椒秸秆青贮品质及细菌多样性的影响［J］.草地学报，2024，32（7）：2230-2336

CHENG Zhi-ze， YISILAYI-Dawuti， WAN Jiang-chun，et al.Effects of Different Additives on the Quality and Bacterial Diversity of Pepper Straw Silage［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2230-2336

Effects of Different Additives on the Quality and Bacterial

Diversity of Pepper Straw Silage

CHENG Zhi-ze， YISILAYI-Dawuti， WAN Jiang-chun， NAIBI-Abulaiti， AIBIBULA-Yimamu*

（College of Prataculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830000， China）

Abstract：In order to explore the effects of different additives on the quality and bacterial community structure of pepper （Capsicum annuum L.） straw silage，fresh pepper straw was used as raw material. The control group （W0，adding the same amount of sterile deionized water），Lactobacillus plantarum group （W1），Lactobacillus plantarum+cellulase group （W2），Lactobacillus plantarum+Bacillus subtilis group （W3），Lactobacillus plantarum+molasses group （W4） and cellulase group （W5） were set up. The nutritional composition，fermentation quality and bacterial community structure were determined after 60 days of silage at room temperature. The results showed that compared with the W0 group，the pH value，neutral detergent fiber （NDF） and acid detergent fiber （ADF） of the additive treatment group decreased，and lactic acid （LA） increased significantly （Plt;0.05）. Compared with other groups，crude protein （CP） and LA in W3 group were higher，and pH，NDF，ADF and NH3-N/TN were lower. The dominant bacteria in the pepper straw raw material （WY） and W0 group were Cyanobacteriota and Oscillatoria，and the dominant bacteria in other treatment groups were Bacillota and Lactiplantibacillus. In summary，additives could improve the quality of pepper straw silage，and the quality of pepper straw silage treated with Lactobacillus plantarum+Bacillus subtilis was the best.

Key words：Pepper straw;Fermentation quality;Bacterial community structure;Cyanobacteriota;Bacillota

收稿日期：2024-02-19；修回日期：2024-03-24

基金项目：新疆重点研发计划项目“新疆地源性生物发酵饲料调配关键技术研究”（2022B02042-2）资助

作者简介：

程志泽（1984-），男，汉族，甘肃庄浪人，博士研究生，主要从事饲草料加工与反刍动物营养研究，E-mail：627840293@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：aibibula@hotmail.com

近年来，由于我国畜牧业规模化、集约化发展，以及人们对畜产品质量需求不断增加，优质饲草料不足缺口越显凸出，已成为制约畜牧业发展的瓶颈因素［1］。而我国非常规饲料资源丰富，具有很高的潜在饲用价值［2］。辣椒秸秆是非常规饲料资源，粗蛋白含量14.79%～16.72%，营养成分优于羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.）和玉米（Zea mays L.）秸秆，与苜蓿（Medicago sativa L.）接近［3］，同时我国每年辣椒种植面积超过2.1×106hm2，秸秆年产量达6.9×107 t［4］，资源极丰富。尝试将辣椒秸秆青贮处理，开发为反刍动物饲料，可同时缓解饲草料不足和季节供应不平衡问题。

在制作青贮饲料时，使用添加剂能改善原料自身的不足，提升青贮品质。如植物乳杆菌可补充原料同型发酵乳酸菌数量不足［5］；枯草芽孢杆菌能分泌纤维素酶［6］、淀粉酶等系列酶［7-8］；糖蜜富含碳水化合物，可为乳酸菌的生长和繁殖提供额外的单糖来源［9］；纤维素酶可降解植物细胞壁的结构性糖类，为乳酸菌快速繁殖提供更多的可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC）［10］。另外对一些本身符合青贮条件的原料，使用添加剂仍可提高青贮品质，如WSC含量较高的鲜食玉米秸秆或中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（Acid detergent lignin，ADF）较低的构树，在青贮时使用糖蜜或纤维素酶处理后，其青贮品质优于未加添加剂处理组［11-12］。同时，青贮的过程也是微生物演替主导发酵的过程［13］，微生物群落结构与青贮的品质密切相关［14］。因此，研究青贮前后微生物群落结构对了解其品质极其重要。

近年来，辣椒秸秆在饲料开发利用方面逐渐被重视。已有研究证明，饲料中加入10%辣椒秸秆粉饲喂獭兔，能提升其日增重、主要营养物质表观消化率和健康水平［15］。在青贮辣椒秸秆试验中，发现添加阿魏酸酯酶与复合菌液青贮处理后能提高辣椒秸秆的体外产气量、可消化有机物和代谢能，也能提升瘤胃对于氮的利用效率［16］。另外用辣椒秸秆青贮完全代替日粮中的玉米青贮饲喂肉羊，可提高肉羊对饲料营养物质的消化利用率［17］。但目前，辣椒秸秆的饲料开发研究仍处于初期阶段，系统、深入的研究报道较少。因此，本试验以含水量为65%的辣椒秸秆为原料，研究不同添加剂对其青贮营养成分、发酵品质和微生物群落结构的影响，为调制品质优良辣椒秸秆青贮提供理论依据和技术参考。

1" 材料与方法

1.1" 试验材料

参试辣椒秸秆取自新疆昌吉州玛纳斯县境内辣椒种植大田，品种为改良‘陕早红’，末次辣椒采摘后收割秸秆，刈割时留茬2～3 cm，秸秆清洁、无泥土夹杂。经测定其干物质（Dry matter，DM）、NDF、粗蛋白质（Crude Protein，CP）、ADF、粗脂肪（Ether extraction，EE）和WSC含量分别为26.32%FM、15.90%DM、34.97%DM、29.30%DM、2.90%DM和9.57%DM，辣椒素（Capsaicin）含量为82.29±0.14 μg·g-1。植物乳杆菌（1×1011cfu·g-1）、枯草芽孢杆菌（1×1011cfu·g-1）购于潍坊某生物科技有限公司，纤维素酶（2×104 U·g-1）购于上海某生物科技有限公司，糖蜜购于柳州某糖蜜有限公司。

1.2" 试验设计

试验采用单因素完全随机设计。辣椒秸秆收割后在干净的水泥地晾晒并适时翻晒，期间多点取样，采用感官评定和微波炉法［18］相结合的方式测定含水量，待含水量65%时，用粉碎机粉碎至1～3 cm长度，分别将植物乳杆菌（W1）、植物乳杆菌+纤维素酶（W2）、植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌（W3）、植物乳杆菌+糖蜜（W4）和纤维素酶（W5）溶于无菌去离子水中，均匀喷洒在粉碎的辣椒秸秆上，对照组（W0）喷洒等量无菌去离子水，共6个处理，每个处理3个重复，搅拌均匀后装入聚乙烯袋中真空包装并置于室内环境下自然发酵，60 d后取样测定相关指标。各处理添加剂及添加量如表1所列。

1.3" 测定指标与方法

1.3.1" 辣椒秸秆青贮营养成分测定" DM，CP，EE，NDF，ADF含量的测定参照朱进忠［19］的方法；WSC采用硫酸－蒽酮比色法测定［20］；辣椒素含量测定采用高效液相色谱（HPLC）法测量［21］。

1.3.2" 辣椒秸秆青贮发酵品质测定" 取青贮辣椒秸秆鲜样20 g放入250 mL锥形瓶中，加入180 mL灭菌蒸馏水浸泡30 min，用搅拌机充分搅拌30 s，再用4层纱布和定量滤纸先后过滤，得浸提液。用25型酸度计（上海雷磁分析仪器厂，玻璃电极电极）测量浸提液的pH值。取部分浸提液经高速冷冻离心机离心5 min，再经0.22 μm滤膜过滤。参照Cao等［22］的方法，采用高效液相色谱仪测定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）及丁酸（Butyric acid，BA）含量。NH3-N测量采用苯酚-次氯酸钠比色法［23］。总氮（TN）含量计算公式为TN＝CP÷6.25。

1.3.3" 辣椒秸秆原料及其青贮细菌群落结构分析" 将辣椒秸秆原料及不同添加剂处理的青贮辣椒秸秆送至派森诺生物科技公司（南京），用于细菌多样性测序分析。采用PowerSoilDNA Isolation Kit试剂盒提取样品总DNA。选择带有Barcode的338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）为引物，对获取细菌的16s rRNA的V3～V4可变区进行PCR扩增，并且每个样本做3个重复。使用Illumina TruSeq DNA构建测序文库。最后采用Pacbio Sequel三代测序平台对群落DNA片段进行SMRT（Single Molecule Real-Time）测序。

1.4" 数据统计与分析

数据经Excel 2010进行汇总和整理后，使用SPSS 20.0一般线性模型（General Linear Model，GLM）对数据进行方差分析，采用Duncan法进行多重比较检验。优势菌群相对丰度柱状图通过QIIME2软件进行计算。

2" 结果与分析

2.1" 不同添加剂对辣椒秸秆青贮营养成分的影响

由表2可知，W1组DM含量最高，显著高于W0，W2，W4和W5组（Plt;0.05），与W3组之间差异不显著；W3组CP含量显著高于W0，W1，W2和W5组（Plt;0.05），与W4组之间差异不显著，W0与W5组之间CP含量差异不显著，却显著低于其余各组（Plt;0.05）；W1，W2，W3和W5组EE含量显著高于W0组（Plt;0.05），W4与W0组之间EE含量差异不显著；6组辣椒秸秆青贮之间WSC含量差异不显著；W3与W4组之间NDF和ADF含量显著低于其余各组（Plt;0.05），且W3组NDF含量显著低于W4组（Plt;0.05）；W3组辣椒素含量最高，显著高于其余各组（Plt;0.05），W4和W5组辣椒素含量最低，且他们之间差异不显著。

2.2" 不同添加剂对辣椒秸秆发酵品质的影响

由表3可知，W3组LA含量最高，显著高于其他各组（Plt;0.05），W4与W2组LA含量差异不显著，却显著高于W1，W5和W0组（Plt;0.05）；W0组pH值和PA含量显著高于其他各组（Plt;0.05），W3组pH值和PA含量最低，与W1，W2和W4组之间的pH和PA含量差异不显著，但显著低于W5组（Plt;0.05）；W3和W4组的NH3-N/TN显著低于其他4组（Plt;0.05），且W3组的NH3-N/TN显著低于W4组（Plt;0.05），W0与W5之间NH3-N/TN差异不显著，显著高于W1和W2组（Plt;0.05）；6组青贮均未检测到BA。

2.3" 不同添加剂对辣椒秸秆青贮细菌群落结构的影响

2.3.1" 辣椒秸秆原料及不同添加剂处理青贮的稀释曲线" 由图1可知样本测序数据量为5 600个，随着测序数据量的增加，稀释曲线趋于平缓，说明本次测序结果合理，继续增加测序深度无法发现新的扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variant，ASV）。WY为辣椒秸秆原料，W0，W1，W2，W3，W4和W5分别是不同添加剂处理的辣椒秸秆青贮。从图可知随着稀释曲线趋于平坦时，W1组曲线最高，其次是W5组，WY组最低，说明添加剂处理组辣椒秸秆青贮细菌丰度均高于辣椒秸秆原料，且W1组细菌丰度最高，其次是W5组。

2.3.2" 辣椒秸秆原料及不同添加剂处理青贮细菌群落结构分析

（1）门水平的细菌群落结构分析

由图2可知WY和W0组优势菌为蓝藻门（Cyanobacteriota），占比分别为96.00%和88.78%，另外WY组还有3.83%的假单胞菌门（Pseudomonadota），W0组有10.08%的芽孢杆菌门（Bacillota）；W1，W2，W3，W4和W5组的优势菌为芽孢杆菌门（Bacillota），占比分别为86.36%，88.51%，99.74%，98.15%和93.48%，同时部分组还含有少量的蓝藻门（Cyanobacteriota）、假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomytota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、支原体门（Mycoplasmatota）和弯曲菌门（Campylobacterota）等。

（2） 属水平细菌群落结构分析

由图3可知WY和W0优势菌为颤藻属（Oscillatoria），分别占95.88%和88.42%，另外WY组还有3.74%鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），W0组有9.27%的乳植物杆菌属（Lactiplantibacillus）；W1、W2、W3、W4和W5组优势菌为乳植物杆菌属（Lactiplantibacillus），占比分别为65.50%，82.33%，70.40%，77.48%和90.48%，同时部分处理组还含有少量的芽孢杆菌属（Bacillus）、颤藻属（Oscillatoria）、促生乳杆菌属（Levilactobacillus）、迟缓乳杆菌属（Lentilactobacillus）和乳杆菌属（Lactobacillus）等，另外W3和W4组含芽孢杆菌属（Bacillus）较高，分别为29.32%和20.59%。

3" 讨论

3.1" 不同添加剂对辣椒秸秆青贮养分含量的影响

青贮的作用是原料在密闭缺氧条件下，通过厌氧乳酸菌发酵作用抑制各种杂菌繁殖，减少养分损失，从而改善原料品质。但有些原料因自身条件不足或为尽可能的改善原料质量，会选择合适的添加剂为乳酸菌创造理想的发酵环境。本研究结果表明，添加剂对辣椒秸秆青贮营养成分有一定影响作用。各添加剂组与W0组相比，除W5组CP，NDF和ADF与W0组差异不显著外，其余各添加剂组CP均高于W0组，NDF和ADF显著低于W0组，说明使用W1，W2，W3和W4添加剂能改善辣椒秸秆青贮营养成分，这与包健［24］、詹佳琦［25］和王凤林［26］等人在不同原料中使用相同添加剂青贮结果相似。而W5相关指标与W0差异不显著，说明纤维素酶单独添加对辣椒秸秆青贮养分改善效果不明显，这与万荣［27］等人研究结果相反，可能主要原因是原料及其处理条件不同所造成；各添加剂组之间相比较，W3组CP，EE，WSC和辣椒素最高，NDF和ADF最低，说明植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌一起添加效果最好，这与穆胜龙等［28］研究结果相同，原因是W3组中植物乳杆菌增加了辣椒秸秆青贮初期乳酸菌的数量，快速产生大量乳酸抑制梭菌等不良微生物增殖，从而减少CP等营养成分和辣椒素的分解，同时大量乳酸等有机酸会酸解辣椒秸秆细胞壁，使NDF含量降低［29］；另外，枯草芽孢杆菌能够分泌纤维素酶、淀粉酶等多种酶系［28］，可分解辣椒秸秆中纤维素和淀粉等成分为可溶性糖，既达到分解细胞壁NDF和ADF作用，还为乳酸菌发酵补充了底物。相比W1组，W4组青贮的CP，WSC和LA含量较高，而NDF，ADF含量和NH3-N/TN降低，青贮效果更好，说明同时添加植物乳杆菌和糖蜜效果优于单独添加植物乳杆菌，可能是在辣椒秸秆原料中同时使用植物乳杆菌和糖蜜，既迅速增加了乳酸菌数量，又为其快速增殖和发酵提供充足的底物，这与刘辉等的研究结果一致［30］。本研究中，W2组青贮的LA含量显著高于W1和W5组，NH3-N/TN低于W1和W5组，因此W2处理组的发酵品质优于W1和W5组，说明在辣椒秸秆青贮时，植物乳杆菌和纤维素酶协同作用效果优于两者单独使用，原因可能是通过协同作用，纤维素酶能进一步将辣椒秸秆细胞壁结构性多糖降解为单糖，为乳酸发酵提供更多的可溶性糖，通过乳酸菌发酵改善了青贮品质，同时还可能因添加的纤维素酶抑制了腐败菌的增殖所致［31］。另外，W3处理辣椒秸秆青贮含有79.23 μg·g-1辣椒素，显著高于其他各添加剂处理组，但该辣椒素含量在辣度评价分级中与其他处理辣椒秸秆青贮组结果相同，均属3级［32］。

3.2" 不同添加剂对辣椒秸秆青贮发酵品质的影响

在青贮饲料中，pH、LA和NH3-N/TN是衡量发酵品质的主要指标，优质青贮饲料pH标准为3.80～4.20。NH3-N/TN低于10%［33］，LA含量越高，则发酵效果越好［34］。本研究中，各添加剂组与W0组相比较，pH和NH3-N/TN低于W0组，且各添加剂处理组均pH低于4.20，NH3-N/TN低于10%，达到优质青贮饲料的标准，同时各添加剂组LA含量均显著高于W0组，所有处理组均未检测到BA，说明辣椒秸秆经添加剂处理后青贮能改善其发酵品质，这与覃娟清［35］等在青贮笋壳上研究结果相一致；各添加剂组之间相比较，W3组pH和NH3-N/TN最低，LA最高，说明在辣椒秸秆青贮中添加剂使用植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌时发酵品质最好，这与王凤林［26］等在玉米秸秆青贮中人研究结果相同，原因可能是添加剂中的植物乳杆菌能迅速增加乳酸菌数量，加快乳酸发酵速度，同时枯草芽孢杆菌通过产生抗菌肽类物质等途径，抑制不良菌生长［36］，为乳酸菌增殖、发酵创造有利条件，从而减少辣椒秸秆粗蛋白等营养成分的分解，使NH3-N/TN降低。

3.3" 不同添加剂对辣椒秸秆青贮细菌群落结构的影响

青贮是一个复杂的微生物相互作用过程，在诸多复杂微生物体系中，细菌占据了主要位置，因此，通过分析青贮饲料中细菌群落结构，可在一定程度上能对青贮饲料营养价值和发酵品质作进一步的了解。

由稀释性曲线可知，随着样品测序深度增加，稀释曲线均逐渐趋于平缓，说明样品测序结果合理，能全部反映出其细菌的多样性［37］，继续增加测序深度无法发现新的ASV。在门水平上，辣椒秸秆原料及其不同处理的青贮优势菌为芽孢杆菌门（Bacillota）和蓝藻门（Cyanobacteriota），芽孢杆菌门即厚壁菌门（Firmicutes），研究证明其多数革兰氏染色呈阳性，而且在缺水等极端环境之下，能产生芽孢保持生存，同时研究发现，许多芽孢杆菌门中细菌通过对淀粉、纤维素和蛋白质等大分子化合物进行降解［38］，为微生物活动提供更多底物［39］。乳杆菌属是芽孢杆菌门一主要的菌属，对青贮品质有显著影响［40］。通过比较发现，WY和W0中优势菌为蓝藻门，这与张娟等［41］在圆叶决明子中添加苹果酸和嗜酸杆菌后青贮结果相似，说明辣椒秸秆本身附着益生菌较少，直接青贮效果不佳。而其余各添加剂处理组的辣椒秸秆青贮优势菌为芽孢杆菌门，与刘蓓一［42］和陶莲等［43］研究结果一致，说明在辣椒秸秆青贮时，使用添加剂能增加有益菌的丰度，从而抑制有害菌增殖。

在属水平上，辣椒秸秆原料及不同处理青贮主要优势菌为乳植物杆菌属（Lactiplantibacillus）和颤藻属（Oscillatoria）。WY和W0的优势菌为颤藻属（Oscillatoria），乳杆菌属等有益菌较低，而颤藻属属蓝藻门，能释放藻毒素和异臭物质［44］，不利于青贮，从而从微结构层面说明辣椒秸秆原料不宜直接青贮。而W1，W2，W3，W4和W5组青贮的优势菌为乳植物杆菌属（Lactiplantibacillus），另外还有少量迟缓乳杆菌属（Lentilactobacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、促生乳杆菌属（Levilactobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus）等乳酸菌［45］，在青贮饲料中，乳酸菌能抑制其他有害菌增殖，对青贮饲料起防腐作用，是制作优良青贮饲料的主要微生物［46］，这说明辣椒秸秆经不同添加剂处理后青贮，可改变微生物群落结构，增加乳酸菌的丰度，提升品质，这与孙文涛等［47］在构树青贮中研究结果相似。另外W3和W4组除了乳植物杆菌属为优势菌外，还含有较高比例（分别为29.32%和20.59%）的芽孢杆菌属，加之W3和W4组营养成分和发酵品质较高，说明在青贮辣椒秸秆中，适宜的芽孢杆菌属有利于提升青贮质量。这与李钰等［48］和孙宇等［49］在发酵饲料中添加枯草芽孢杆菌的研究结果相似。另外，W0处理的辣椒秸秆青贮pH值为4.23，虽然显著高于其他添加剂处理组，但与优质青贮pH值范围接近，主要原因可能与其含有10.08%的芽孢杆菌门、9.27%的乳植物杆菌属有关。

4" 结论

辣椒秸秆经添加剂处理后能改善青贮品质，使用植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌作添加剂青贮效果最佳。另外，辣椒秸秆经青贮处理后辣椒素含量降低。

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