苯乳酸和温度对玉米秸秆青贮发酵品质及抗性基因的影响

摘要：本研究旨在探究不同温度下添加不同浓度苯乳酸（Phenyl lactic acid，PLA）对玉米（Zea mays L.）秸秆青贮饲料发酵品质、抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）和可移动遗传元件（Mobile genetic genes，MGEs）丰度变化的影响。采用双因素（苯乳酸×温度）完全随机设计，温度设定20℃和30℃，苯乳酸设置添加组（0.2% PLA和0.4% PLA）和对照组（CK），30 d后取样分析青贮品质。结果显示，与对照组相比，随着PLA浓度增加，两种温度下的pH值、乳酸菌数量和乙酸含量均显著增加（Plt;0.05）。酵母菌数量随着PLA浓度增加而增加，而乳酸和氨态氮含量随之下降。与20℃相比，30℃条件下自然青贮的玉米秸秆饲料pH值显著增加，乳酸菌数量显著下降（Plt;0.05）。本试验所检测的ARGs属于大环内脂类、磺胺类和四环素类抗性基因，添加PLA发酵30 d后，与对照组相比，这些ARGs和MGEs绝对丰度均显著下降（Plt;0.05），其中sul1，sul2，sul3，ermB，tetC与Tn916/1545丰度变化趋势相似，Pearson相关性分析发现两者之间具有极显著正相关关系（Plt;0.01）。综上，两种温度条件下，添加PLA对玉米秸秆青贮发酵品质均具有改善作用，可以减少ARGs的污染。

关键词：玉米秸秆；抗生素抗性基因；苯乳酸；温度；青贮

中图分类号：S816.5+3""" 文献标识码：A""""" 文章编号：1007-0435（2024）07-2290-07

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.030

引用格式：

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YANG Dan， YIN Han-xue， ZHANG Qing.Impacts of Phenyllactic Acid and Temperature on the Fermentation Quality and Antibiotic Resistance Genes of Corn Straw Silage［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2290-2296

收稿日期：2024-04-17；修回日期：2024-05-21

基金项目：国家重点研发项目（2022YFE0111000-2，2022YFD1300901）资助

作者简介：

杨丹（1999-），女，汉族，硕士研究生，江西南昌人，主要从事牧草青贮加工研究，E-mail：ydycbwywtb@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zqing1988@126.com

Impacts of Phenyllactic Acid and Temperature on the Fermentation Quality and

Antibiotic Resistance Genes of Corn Straw Silage

YANG Dan， YIN Han-xue， ZHANG Qing*

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou，

Guangdong Province 510642， China）

Abstract：This study aimed to investigate the effects of adding different concentrations of phenyl lactic acid （PLA） at various temperatures on the fermentation quality，abundance changes of antibiotic resistance genes （ARGs），and mobile genetic elements （MGEs） of corn （Zea mays L.） straw silage. A two-factor completely randomized design was employed，with PLA concentration and temperature as the factors. The experimental groups included a control group （CK） and addition groups （0.2%PLA and 0.4%PLA） at temperatures of 20℃ and 30℃. After 30 days，samples were collected for analysis of silage quality. The results revealed that the addition of PLA significantly increased the pH value and the quantity of lactic acid bacteria at both temperatures （Plt;0.05）. At a storage temperature of 20℃，there was a significant increase in acetic acid content （Plt;0.05），while ammonia nitrogen content decreased. Moreover，the number of lactic acid bacteria and butyric acid content were significantly higher at 20℃ compared to 30℃ （Plt;0.05）. The detected ARGs in this experiment belonged to the macrolide，sulfonamide，and tetracycline classes of resistance genes. After 30 days of fermentation with PLA addition，the absolute abundances of these ARGs and MGEs significantly decreased （Plt;0.05）. Among them，sul1，sul2，sul3，ermB， tetC，and Tn916/1545 exhibited similar trends in abundance changes，and Pearson correlation analysis revealed a highly significant positive correlation between them （Plt;0.01）.In conclusion，the addition of PLA to corn straw silage improved the fermentation quality and reduced pollution from ARGs under both temperature conditions.

Key words：Corn straw;Antibiotic resistance genes;Phenyllactic acid;Temperature;Silage

玉米（Zea mays L.）是我国的主要粮食作物之一，其种植面积大，给我国提供了丰富的秸秆资源［1］。玉米秸秆作为我国反刍家畜的主要粗饲料来源，含有丰富的营养成分，在实际生产中，由于收获期早、含水量高等因素，玉米秸秆的使用十分困难，一旦处理不当，不仅加剧环境污染，还会造成生物资源浪费［2］。青贮是一项提高秸秆利用率且能够有效解决北方春冬季节饲料均衡供应问题的重要技术，将玉米秸秆进行青贮处理可以有效解决畜牧业青贮饲料短缺问题，是一种经济实用的饲料化利用方式［3］。

人类大量滥用抗生素，导致不同生态环境下逐渐出现较多具有抗生素抗性且携带抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的微生物［4-5］。大量研究表明，ARGs可从被污染的土壤、水源和粪便中通过水平基因转移，从一个微生物菌株转移至另一个微生物菌株，相互获得抗性基因，再由根际或叶际微生物菌群转移至植物中，携带ARGs的细菌以多种方式定植在植物体内，最终通过食物链传递到人体［6-8］。Wu等［9］在玉米籽粒青贮饲料通过宏基因组学手段检测到ARGs的存在，发现添加香兰素能够提高青贮饲料发酵品质，但可能导致ARGs向食用青贮饲料的反刍动物转移。饲料在青贮发酵过程中产生的有害污染物，会在动物饲料与环境中长期存在，进而在食物链中积累，危害动物健康及畜产品安全［10］。ARGs作为近年来严重威胁人类健康的污染物，迫切需要人们采取有效措施来控制ARGs的大量传播。

苯乳酸（Phenyl lactic acid，PLA）作为一种具有广谱抑菌效果的新型天然生物防腐剂，安全系数和稳定性较高，可抑制食源性致病菌、腐败菌，特别是能防止真菌污染，被广泛应用于食品保鲜领域［11-12］。有研究发现，在经过青贮废水处理的水稻秸秆中添加不同浓度的苯乳酸，无论添加量如何，均有助于厌氧发酵时挥发性脂肪酸的形成，具备生产可再生能源的潜力［13］。Lu等［14］发现在芦苇金丝雀草饲料中添加苯乳酸，有助于乳酸菌迅速增殖，抑制酵母菌生长，提高青贮饲料发酵品质。Wang等［15］发现在蛋鸡饲料中添加苯乳酸，不仅短期内可以增强蛋鸡的免疫力，还可以提高鸡蛋的产量与品质，同时提高饲料的利用率。然而，目前大多数研究报道都集中在苯乳酸对青贮饲料发酵品质的改善作用，关于添加苯乳酸对玉米秸秆青贮饲料发酵品质和ARGs丰度影响的研究较少［16］。

另外，环境温度对于青贮发酵是重要的影响因素之一［17］，中国南方地区高温多雨的气候条件可能对青贮饲料制作与贮藏造成一定负面影响。发酵过程中受气候环境影响，青贮饲料的营养物质和微生物结构也会随之变化。因此，本研究通过实时荧光定量技术对两种温度条件下经过不同浓度的苯乳酸处理的玉米秸秆青贮饲料进行分析，为促进玉米秸秆在畜牧业中的应用，提升饲料品质，生产营养安全的青贮饲料提供科学依据，同时为降低ARGs的传播风险提供了新思路。

1" 材料与方法

1.1" 试验原料

本试验所选用的玉米为‘华美甜12号’，种植于华南农业大学启林北试验田（23°16′ N，113°36′ E），玉米秸秆为2023年12月收割的蜡熟期去穂玉米秸秆，苯乳酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司。

1.2" 试验设计

本试验采用双因素完全随机设计，因素一为添加不同浓度的苯乳酸，分别为0.2% PLA（PLA1）和0.4% PLA（PLA2），将添加等量的无菌生理盐水作为对照（CK）组;因素二为不同贮藏温度，分别为20℃（L）和30℃（H）。采集的新鲜玉米秸秆原料用铡刀切成2 cm左右的大小，将不同浓度的苯乳酸喷洒在原料上混合均匀，之后把样品分别装入聚乙烯塑料包装（20 cm×30 cm）袋中，每袋约100 g，真空密封机进行密封，共制作24袋青贮样品（6个处理×4个重复），按照20℃和30℃分别进行较低温和较高温青贮，青贮30 d后分析青贮饲料发酵品质。

1.3" 青贮饲料发酵品质测定

1.3.1" 微生物数量测定" 青贮30 d后开袋，混合均匀后使用五点法称取样品10 g，并注入90 mL无菌生理盐水充分振荡后逐层稀释，取100 μL不同梯度稀释菌液涂布在孟加拉红琼脂培养基上，28℃恒温培养箱培养2 d以便于酵母菌和霉菌计数。取1 mL不同梯度菌液于MRS琼脂培养基和结晶紫中性红胆盐琼脂培养基中，37℃培养乳酸菌和大肠杆菌2 d后计数（所使用的培养基均购于广州鼎国生物技术有限公司）［18］。

1.3.2" pH值及有机酸测定" 从样品中取10 g于自封袋中与90 mL蒸馏水混合摇匀，放置4℃冰箱保存24 h后取出，用滤纸过滤后使用雷磁PHS-3C型pH计（上海市精密科学仪器有限公司）测定滤液的pH值。剩余滤液经0.22 μm孔径的滤膜进行过滤，采用岛津GC-14型高效液相色谱仪测定有机酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量［19］。

1.3.3" 化学成分测定" 采用蒽酮比色法测定可溶性碳水化合物，用葡萄糖制作标准曲线，将样品煮沸10 min，冷却过滤定容，吸取摇匀后加入蒽酮，在620 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算原料中所含可溶性碳水化合物含量［20］。取适量样品，称重记录，置于65℃恒温干燥箱烘干48 h，计算样品烘干后的重量与烘干前的重量的百分比就是干物质含量。

1.4" 引物设计与合成

一共检测了5种抗生素抗性基因，2种可移动基因元件（Mobile genetic elements，MGEs），包括磺胺类抗性基因（sul1，sul2和sul3）、大环内酯类抗性基因（ermB）、四环素类抗性基因（tetC）以及MGEs（intl1和Tn916/1545）。引物序列均由北京擎科生物科技股份有限公司合成，具体引物序列和退火温度详见表1。

1.5" 样品总DNA提取

选用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取试剂盒，依照说明书提取玉米秸秆DNA。提取的DNA样本通过NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定其浓度和纯度，保存于-20℃冰箱储存以便后续检测ARGs和MGEs。

1.6" 荧光定量PCR

设计完ARGs引物，采用PCR仪对ARGs进行定性检测。反应体系为20 μL。PCR混合物为：8 μL Nuclease-free ddH2O，正向与反向引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，DNA模板1 μL（其中DNA浓度范围为10 ng·μL-1 ～ 103 ng·μL-1）。PCR升温程序为：在95℃下初始变性3 min，在94℃下变性25 s，在退火温度下退火25 s，72℃下延伸15 s，共进行35个循环，最后在72℃下延伸5 min。将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，观察目的基因片段，若条带亮度高且单一，进行切胶回收，获得目的基因片段。将目的基因片段连接至pGEM-T Easy载体，导入大肠杆菌（E.coli）感受态细胞DH5α，接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选。挑选阳性克隆子接种于LB液体培养基培养过夜，提取质粒DNA，检测DNA浓度和纯度，然后由生工生物工程（上海，中国）股份有限公司测序分析，结果在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，确保质粒中存在目的基因。

1.7" 标准曲线的制作

根据周雨婷［5］研究报道的公式计算目的基因拷贝数（copies）。将质粒DNA进行10倍梯度稀释进行qPCR扩增制作标准曲线。使用RocheLightCycler480 PCR仪对ARGs进行定量分析，定量PCR引物与上述定性PCR测定中使用的相同，每个样品均设3组平行样。熔解曲线分析用于检测是否存在非特异性扩增。qPCR标准曲线的平方相关系数R2gt;0.99，扩增效率为90%～110%，用于计算ARGs拷贝数。

1.8" 数据统计与分析

所有的统计分析均使用SPSS 24.0软件完成，采用单因素方差分析以及Turkey法对不同浓度的苯乳酸添加处理的平均值差异进行多重比较，如果Plt;0.05，代表显著性，并用不同字母标记。利用GraphPad Prism 8绘制ARGs和MGEs绝对丰度的柱状图。

2" 结果与分析

2.1" 对玉米秸秆发酵品质的影响

不同温度下添加苯乳酸对玉米秸秆青贮发酵品质的影响如表2所示。随着苯乳酸浓度增加，与对照组相比，两种温度条件下的pH值，乳酸菌数量和乙酸含量均显著增加（Plt;0.05）。酵母菌数量随着苯乳酸浓度增加而增加，而乳酸和氨态氮含量随着苯乳酸浓度增加而减少。与20℃相比，30℃条件下自然青贮的玉米秸秆饲料pH值显著下降，乳酸菌数量显著升高（Plt;0.05）。

2.2" 对玉米秸秆青贮中ARGs和MGEs绝对丰度的影响

如图1所示，青贮30天后添加苯乳酸对ARGs和MGEs的绝对丰度有显著性影响（Plt;0.05）。与CK相比，除较高温下PLA组的ermB，其余添加苯乳酸各处理组的ARGs丰度均显著下降（Plt;0.05）。其中，较低温条件下添加PLA，tetC绝对丰度降幅最大，从102.85拷贝数·g-1降低到102.38拷贝数·g-1和102.1拷贝数·g-1，降低了66%和82%；sul3绝对丰度降幅最小，由103.42拷贝数·g-1降低到103.20拷贝数·g-1和103.23拷贝数·g-1，仅降低了40%和35%；较高温条件下添加PLA，sul3绝对丰度下降幅度最大，由104.49拷贝数·g-1降低到103.22拷贝数·g-1和103.22拷贝数·g-1，降低了95%和95%；ermB的丰度降幅最小，由103.38拷贝数·g-1降低到103.06拷贝数·g-1和103.27拷贝数·g-1，仅降低了52%和22%。与CK相比，添加苯乳酸均显著降低了MGEs的绝对丰度（Plt;0.05）。其中，Tn916/1545的去除率最高，在83%～87%之间；intl1的去除率在21%～79%之间。

2.3" ARGs与MGEs之间相互关系

ARGs与MGEs之间的Pearson相关性分析见表3。结果显示，sul1，sul2，sul3，ermB和tetC的绝对丰度与Tn916/1545的绝对丰度极显著正相关（Plt;0.01），sul1，sul2，sul3和tetC的绝对丰度与intl1的绝对丰度极显著负相关（Plt;0.01）。

3" 讨论

3.1" 对玉米秸秆青贮发酵品质的影响

在青贮过程中，乳酸菌迅速生长对青贮饲料发酵品质至关重要［17］。本研究中，添加0.2%PLA后乳酸菌数量较CK组显著增加。常规青贮条件下，乳酸菌分解植物中的可溶性糖等发酵底物产生乳酸等有机酸，迅速降低pH值，抑制其他不良微生物的生长［18］。但有研究表明，PLA能抑制乳酸菌的活性，可能对青贮过程中LAB的产酸能力造成影响［24］。因此，本研究中两种温度下PLA处理的乳酸含量均低于CK组，PLA处理组的pH值均高于CK组。尽管添加PLA使pH值增加，但CK组和PLA1组的pH值均小于4.2，符合良好青贮发酵条件［25］。发酵30天后，所有PLA处理的酵母菌数量，PA和BA含量均高于CK组，可能是因为厌氧发酵过程中乳酸含量降低，pH值增加，微生物之间相互竞争营养物质，酵母菌、梭菌等不良微生物利用可溶性糖等营养物质产生乙醇、丁酸和氨等难闻气体，降低青贮发酵品质［26］。随着贮藏温度的升高，乳酸菌在高温下不适宜生长，温度越高乳酸菌数量越低，使得乳酸含量也越低，pH值越高，这一结论与李梦玉研究报道相符［27］。

3.2" 对玉米秸秆ARGs和MGEs绝对丰度的影响

在玉米秸秆青贮中检测的ARGs大部分为大环内脂类、磺胺类和四环素类抗性基因［28］。磺胺类在畜禽养殖中常被单独或与其他抗生素联用于预防和治疗腹泻等细菌性感染疾病［6］。大环内酯类是欧洲养牛生产中治疗许多感染的常用药物［10］。有研究在植物乳杆菌培养物中发现的苯乳酸能够抑制多种真菌和致病菌的生长，应用于动物饲料中可能成为抗生素的替代品［15］。Zhang等［8］研究发现在紫花苜蓿青贮饲料中ARGs的主要载体以有害细菌或病原菌为主，添加乳酸菌后ARGs丰度降低是因为减少了ARGs宿主细菌。在本研究中，这些ARGs均被检测到，青贮30天后，添加PLA的玉米秸秆青贮饲料中ARGs绝对丰度显著下降，可能是由于乳酸菌发酵产生的PLA，抑制了携带ARGs的致病菌的增殖，从而降低ARGs的丰度，这一结果与许冬梅研究报道相似［29］。有研究认为温度是引起ARGs变化的关键因素之一，尤其在堆肥过程中长时间的高温期和较高的堆体温度对大多数ARGs潜在宿主微生物有消除作用［30］。与堆肥发酵不同，青贮过程中乳酸菌更适宜在30℃生长，一旦温度超过50℃，乳酸菌将停止生产乳酸，杂菌大量增殖，容易造成营养损失［31］。因此，本研究中无论较高温还是较低温条件，对玉米秸秆青贮的ARGs变化不大。然而添加苯乳酸后，较低温下PLA1处理组的ARGs丰度变化更显著，较高温下PLA2处理组的ARGs丰度变化更显著。

3.3" ARGs与MGEs之间相关性分析

由质粒、转座子和整合子等组成的MGEs能够促进ARGs在微生物之间发生水平基因转移［32］。Jacobsen等［33］通过大鼠作为体内模型，发现从发酵干香肠中分离的L. plantarum DG 522和L. plantarum DG 507可以通过可转移质粒将抗性基因tet（M）、erm（B）转移至E.faecalis JH2-2。一些研究表明水平基因转移是ARGs传播的重要途径［34］。先前研究认为sul1与intl1基因有关，能够在环境微生物之间进行水平转移，但在本研究中发现sul1与intl1显著负相关，与宋磊等人结论相似［35］。与此同时，sul1，sul2，sul3，ermB，tetC与Tn916/1545呈极显著正相关关系，添加PLA显著降低了Tn916/1545的丰度，说明添加PLA能够降低转座酶上ARGs的丰度，抑制转座酶诱导下ARGs的水平基因转移，这也解释了青贮后PLA处理组sul1，sul2，sul3，ermB和tetC的绝对丰度比CK组下降的多。Zhang等［7］研究表明随着青贮时间的延长，高丰度的MGEs伴随着高水平基因转移潜力。因此，可以推测ARGs的降低可能通过抑制MGEs引起的水平基因转移实现，说明添加苯乳酸能有效去除青贮过程中的ARGs。

4" 结论

玉米秸秆青贮饲料中ARGs种类丰富，MGEs是影响ARGs丰度变化的因素之一。添加苯乳酸后，不管任何温度条件，青贮饲料中ARGs和MGEs丰度均显著降低。添加苯乳酸不仅可以改善玉米秸秆青贮饲料发酵品质，还能减少ARGs的污染，其中在20℃贮藏温度下PLA1的ARGs丰度变化更显著，在30℃贮藏温度下PLA2的ARGs丰度变化更显著。

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（责任编辑" 闵芝智）