甘南地区青贮牧草耐低温乳酸菌的筛选与鉴定

摘要：为筛选出适宜高寒地区低温青贮的优良乳酸菌菌株，本试验从箭筈豌豆（Vicia sativa）、小黑麦（Triticosecale wittmack）和燕麦（Avena sativa）3种牧草青贮饲料中分离乳酸菌菌株并通过低温控制培养及产酸试验进行筛选，对菌株进行形态、生理生化鉴定及16S rDNA同源性分析。结果表明，从3种牧草青贮牧草分离纯化得到42株乳酸菌，筛选得到具有较强低温生长能力和产酸能力的10株耐低温乳酸菌，其中7株为同型发酵乳酸菌，3株为异型发酵乳酸菌，10株菌株都具有较好的耐酸性、耐盐性和耐温性，经同源性测序分析菌株GN1，GN3和GN10为植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），菌株GN2，GN4和GN7为短乳杆菌（Levilactobacillus brevis），菌株GN5和GN6为弯曲乳杆菌（Latilactobacillus curvatus），菌株GN8和GN9为清酒乳杆菌（Latilactobacillus sakei subsp.）。结合耐低温乳酸菌产酸能力、低温生长能力和生理生化特性等多种结果综合考虑，植物乳杆菌GN1，GN3和GN10及短乳杆菌GN7适宜作为高原地区低温青贮发酵的备选菌株。

关键词：甘南地区；青贮；低温；乳酸菌

中图分类号：Q939.11+7""" 文献标识码：A""""" 文章编号：1007-0435（2024）07-2305-09

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.032

引用格式：

赵永琦， 尹国丽， 巩海强，等.甘南地区青贮牧草耐低温乳酸菌的筛选与鉴定［J］.草地学报，2024，32（7）：2305-2313

ZHAO Yong-qi， YIN Guo-li， GONG Hai-qiang，et al.Screening and Identification of Low-temperature Tolerant Lactic Acid Bacteria from Silage Grass in Gannan Region［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2305-2313

Screening and Identification of Low-temperature Tolerant Lactic Acid

Bacteria from Silage Grass in Gannan Region

ZHAO Yong-qi， YIN Guo-li*， GONG Hai-qiang， LIANG Wen-bin， LEI Qing

（College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem/Pratacultural Engineering

Laboratory of Gansu Province， Ministry of Education， Lanzhou， Gansu Province 730070， China）

Abstract：In order to screen out excellent lactic acid bacteria strains for low-temperature silage in alpine areas，the experiment isolated lactic acid bacteria strains from three types of pasture silage：Vicia sativa，Triticosecale wittmack and Avena sativa，screened them through low-temperature culture and acid production tests，identified their morphology，physiology and biochemistry，and analyzed 16S rDNA homology. The results showed that 42 strains of lactic acid bacteria were isolated and purified from 3 types of pasture silage，and 10 strains of low-temperature tolerant lactic acid bacteria with strong low-temperature growth ability and acid production ability were screened，of which 7 strains were homofermentative lactic acid bacteria and 3 strains were heterofermentative lactic acid bacteria. All 10 strains had good acid resistance，salt tolerance and temperature tolerance. According to homology sequencing analysis，strains GN1，GN3 and GN10 were Lactiplantibacillus plantarum，strains GN2，GN4 and GN7 were Levilactobacillus brevis，strains GN5 and GN6 were Latilactobacillus curvatus，and strains GN8 and GN9 were Latilactobacillus sakei subsp.. Taking into account various results such as the acid production ability，low-temperature growth ability and physiological and biochemical characteristics of low-temperature tolerant lactic acid bacteria，Lactobacillus plantarum GN1，GN3 and GN10 and Lactobacillus brevis GN7 were suitable as candidate strains for low-temperature silage fermentation in plateau areas.

Key words：Gannan region;Silage;Low temperature;Lactic acid bacteria

收稿日期：2023-12-21；修回日期：2024-03-04

基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-34）；2022年甘肃省高等学校产业支撑计划项目（2022CYCZ-50）资助

作者简介：

赵永琦（1998-），男，藏族，甘肃兰州人，硕士研究生，主要从事饲草学研究，E-mail：835367676@qq.com；*通信作者 Author for correspondence，E-mail：ygl@gsau.edu.cn

甘南地区平均海拔3 000 m，草地面积260.25万 hm2［1］，是青藏高原重要的畜牧业基地［2］。青藏高原海拔较高，气候寒冷，冷季较长，牧草生长期较短，牧草产量低，牧草季节性供给不平衡成为制约甘南地区畜牧业发展的重要因素［3］。发展成本较低的青贮牧草饲料是解决牧草季节性供给不平衡和长期保存牧草饲料的重要方法，也是促进甘南地区畜牧业发展的有效措施。青贮发酵是复杂的微生物活动和生物化学反应过程，多种微生物共同参与发酵过程，乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是青贮过程中的主导微生物，利用饲料中可溶性碳水化合物发酵生成乳酸、乙酸等有机酸，迅速降低青贮环境中pH值，抑制有害微生物生长，达到长期保存的目的［4］。

环境温度对青贮品质影响较大，Zhang等［5］研究发现青贮适宜温度为20～40℃，过高或过低都会影响青贮品质，甘南地区年平均温度1～3℃，低于青贮适宜温度［6］。徐炜［7］研究发现受甘南地区气候条件影响，自然青贮牧草中pH值和氨态氮含量高，干物质、可溶性糖和乳酸含量低，牧草青贮品质差。同时，温度也会影响乳酸菌生长和繁殖并降低其产酸能力，从而延长青贮发酵时间，造成青贮发酵不完全。Pang等［8］发现乳酸菌含量最低为105 cfu·g-1时青贮发酵品质较好，若含量低于104 cfu·g-1 则不能保证青贮品质。苜蓿（Medicago sativa）在4℃条件下青贮30 d后乳酸菌含量达105 cfu·g-1，在25℃条件下青贮15 d后乳酸菌含量达105 cfu·g-1，低温下乳酸菌生长繁殖能力明显降低，青贮发酵所需的时间延长，增加了青贮过程中营养物质的损耗。添加耐低温乳酸菌菌株可以缩短低温发酵时间，保安安等［9］从垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）中分离出的1株耐低温植物乳杆菌进行低温青贮，发现耐低温菌株在低温条件下能够缩短低温青贮时间并减少青贮过程中营养物质的消耗。添加耐低温乳酸菌可以降低低温对青贮品质的影响［10］，柴继宽等［11］将筛选出的耐低温乳酸菌添加至燕麦（Avena sativa L.）中在15℃，10℃和5℃下青贮45 d后发现其与空白对照组及商用对照组相比均显著改善了青贮饲料的青贮品质。

筛选适宜高寒地区环境的耐低温乳酸菌是解决饲料青贮时间长、发酵不完全问题的有效方法。因此，本试验以甘南地区3种常见饲用牧草资源为材料，分离筛选出具有良好耐低温能力和产酸能力的本土菌株，以期为解决牧草季节性供给不平衡和牧草饲料长期保存的问题提供适宜低温青贮的乳酸菌菌种资源，为青藏高原地区牧草青贮生产提供依据。

1" 材料与方法

1.1" 试验样品

试验地位于甘南藏族自治州夏河县，地理坐标为102°95′N，34°99′E，海拔高度2 690 m，该地区气候为高原大陆性气候，平均气温在1～13℃之间，寒冷湿润，年均温普遍低于3℃，气温年较差一般在20～22℃之间［12］。

样品处理：于2022年9月17日在试验地收获结荚期箭筈豌豆（Vicia sativa）、完熟期小黑麦（Triticosecale wittmack）和乳熟期燕麦（Avena sativa），将箭筈豌豆、小黑麦和燕麦草样剪碎至2～3 cm，用30 cm×30 cm聚乙烯袋装500 g草样后真空密封，培养箱5℃温度下进行青贮。

菌种来源：乳酸菌分离于青贮120 d箭筈豌豆、小黑麦和燕麦样品中，保存于-80℃超低温冰箱。

1.2" 乳酸菌的分离与纯化

取青贮120 d小黑麦、箭筈豌豆和燕麦样品5 g放入45 mL无菌水，摇床150 r·min-1震荡12 h，取1 mL加入到装有9 mL无菌水的试管中进行稀释，依次稀释至10-3，10-4，10-5，10-6和10-7倍5个梯度，于10-4，10-5，10-6和10-7倍4个浓度梯中分别取200 μL在MRS固体培养基上涂布后放置37℃恒温培养箱中进行培养，培养24～48 h［13］，挑选典型菌落，进行平板划线纯化培养，不断纯化培养直到获得纯菌株。将纯化后的纯菌株进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶测验，将革兰氏染色阳性和过氧化氢酶阴性菌株［14］用MRS液体培养基进行富集，与甘油混合封装，置于-80℃超低温冰箱中保存备用［15］。

1.3" 耐低温乳酸菌筛选

将菌株于液体培养基中活化2次，以2%相对体积接种量分别接种于pH值为3.0，4.0，5.0和6.0的MRS液体培养基中培养24 h，每株取3个平行样测定pH值，探究乳酸菌的耐酸能力；以2%相对体积接种量接种于MRS液体培养基，分别放置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃和45℃温度条件下培养2 d，每株取3个平行样测定在波长600 nm时的OD值，探究乳酸菌对不同温度的适应能力；以2%相对体积接种量分别接种于NaCl浓度为3.0%，6.0%和9.0%的MRS培养基中培养24 h，每株取3个平行样测定在波长600 nm时的OD值，探究乳酸菌的耐盐能力。根据乳酸菌实际生长状况，筛选出抗逆性强的耐低温乳酸菌菌株进行后续试验。

1.4" 乳酸菌形态及生理生化鉴定

观察乳酸菌的菌体特征，挑取单菌落进行油镜镜检、葡萄糖产气试验及碳水化合物发酵试验，将筛选出的耐低温乳酸菌进行基本生理生化特性检测［16］。

1.5" 耐低温乳酸菌产酸试验及不同温度生长试验

将上述活化后的乳酸菌菌株以2%相对体积接种量接种于MRS液体培养基中，因5℃和10℃温度条件下乳酸菌生长速度较慢，故将温度控制在15℃，25℃和35℃三个温度梯度下培养24 h，以未加菌悬液的空白培养基为对照，每4 h取一次样，每株取3个平行样，测定各样品在波长600 nm时的OD值；将菌株于液体培养基中活化2次，以2%相对体积接种量接种于MRS液体培养基中在37℃温度条件下培养24 h，以未加菌悬液的空白培养基为对照，每4 h取一次样，每株取3个平行样，测定各菌株pH值。

1.6" 乳酸菌16S rDNA的分子鉴定

将活化的菌株富集培养24 h后离心收集菌体，用试剂盒提取细菌DNA，用细菌16S rDNA的通用引物27F，1492R，进行PCR扩增。反应体系：2×PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，9.5 μL ddH2O，总体积为25 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min后4℃保存［17］。检测目的条带后将扩增产物送至擎科生物有限公司，测定耐低温乳酸菌菌株基因序列信息。

将菌株基因序列信息与NCBI网站里的Gene Bank数据库进行比对，选择与测定序列同源性最高的已知分类地位的菌种。从Gene Bank数据库中下载已知菌株的16S rDNA基因序列，与所测菌株的16S rDNA序列采用Clustal进行比对，用MEGA11软件绘制系统发育树（Phylogeny tree），确定各菌株分类地位［18］。

1.7" 数据分析

用Excel 2017进行数据整理，用IBM SPSS Statistics 26软件对数据进行差异性分析，MEGA11软件绘制系统发育树［19］，Origin 2022绘制折线图。

2" 结果与分析

2.1 "乳酸菌分离纯化及低温复筛

通过分离MRS培养基上单个菌株初步获得42株乳酸菌。对筛选出的菌株进行革兰氏染色、接触酶试验和葡萄糖产气试验，将革兰氏染色阳性和过氧化氢酶阴性的菌株于5℃，10℃和15℃下分别进行培养，根据生长状况进行筛选，最终得到10株耐低温乳酸菌（表1）。GN3和GN10菌落颜色呈黄色，10株菌株形状均为杆状，革兰氏染色呈紫色，过氧化氢酶反应呈阴性，其中GN1，GN3，GN5，GN6，GN8，GN9和GN10为同型发酵乳酸菌，GN2，GN4和GN7为异型发酵乳酸菌。

2.2" 耐低温乳酸菌生理生化特性分析

10株耐低温乳酸菌生理生化特性如表2所示，所有菌株均能在pH6.0，5.0和4.0下正常生长，pH3.0时菌株GN1，GN5和GN6可以正常生长，其余菌株可以微弱生长。耐盐性试验中，所有菌株均表现出较好的耐盐性，均能在NaCl浓度为3.00%和6.00%时正常生长；在NaCl浓度为9.00%时GN1菌株和GN10菌株可以微弱生长，其余8种菌株均不能生长。在温度适应性测试中，所有菌株均能在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃和40℃下正常生长；在5℃条件下，菌株GN2，GN4，GN8和GN9可以微弱生长，其他菌株均能正常生长；在45℃条件下，菌株GN2，GN4，GN7和GN9可以微弱生长，其余菌株均能正常生长。

10株乳酸菌碳源发酵试验结果如表3所示，10株菌株均可与果糖、葡萄糖、葡萄糖酸盐、麦芽糖和蜜二糖发生正常反应，均不与鼠李糖发生反应。菌株GN1，GN3和GN10与松三糖微弱反应，与除鼠李糖外的其他碳源均能正常反应，结合伯杰细菌手册（第八版）［20］和他人研究结果［21］，初步推断菌株GN1，GN3和GN10为植物乳杆菌；菌株GN2，GN4和GN7均不与松三糖、七叶苷、山梨醇、甘露糖、水杨素和纤维二糖发生反应，均与棉子糖和乳糖发生微弱反应，GN7菌株与甘露醇与蔗糖发生微弱反应，GN2菌株和GN4菌株均不与甘露醇、蕈糖与蔗糖发生正常反应，但GN7菌株与蕈糖发生正常反应，初步推断菌株GN2，GN4和GN7为同属不同种菌株；GN5菌株和GN6菌株碳源发酵实验结果较为相似，均不与阿拉伯糖、松三糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖和山梨醇发生反应，与其他碳源正常发生反应，故推断GN5菌株和GN6菌株为同属菌株；GN8菌株和GN9菌株均不与松三糖、甘露糖、水杨素、棉子糖、甘露醇、蕈糖、山梨醇和苦杏仁苷发生反应，GN8菌株与半乳糖发生微弱反应，与七叶苷不发生反应，GN9菌株与半乳糖和七叶苷发生正常反应。

2.3" 耐低温乳酸菌产酸能力及低温生长特性

耐低温乳酸菌产酸速率如图1所示，培养4 h时，GN10菌株产酸速率最快，pH值降至5.52，显著低于其他菌株（Plt;0.05）；菌株GN1，GN3，GN6，GN7，GN8和GN10在培养8 h时产酸速率较快，pH值均降至5.0以下，显著低于其他菌株（Plt;0.05）；在培养12 h时GN6菌株产酸速率最快，pH值降至4.09，显著低于其他菌株（Plt;0.05），其次是GN1和GN10菌株，pH值降至4.11，显著低于除GN6菌株外的其他菌株；培养16 h时菌株GN1和GN6产酸速率最快，pH值降低至4.0以下；培养20 h时，除菌株GN2，GN4，GN5和GN9以外，其他菌株pH均降至4.0以下；培养24 h时，GN1菌株产酸速率最快，pH值降至3.69显著低于其他处理（Plt;0.05），其次是菌株GN6，GN7，GN10和GN3，pH值分别降至3.77，3.78，3.82和3.85，显著低于其他菌株（Plt;0.05）。

耐低温乳酸菌在15℃下的生长速率如表4所示，在0～8 h时，GN6菌株生长速率最快，其次是GN1菌株，GN9菌株生长速率最慢，菌株GN1，GN3，GN6，GN7，GN8和GN10处于对数生长期；在8～12 h时，GN1菌株生长速率最快，显著高于其他菌株（Plt;0.05），GN9菌株生长速率显著低于其他菌株（Plt;0.05），菌株GN2，GN4，GN5和GN9处于对数生长期；在12～16 h时，GN1菌株生长速率最快显著高于其他菌株（Plt;0.05），GN9菌株生长速率最慢显著低于其他菌株（Plt;0.05）；在16～24 h时GN1菌株生长速率最快显著高于其他菌株（Plt;0.05），其次是GN7菌株和GN6菌株。

耐低温乳酸菌在25℃下的生长速率如表5所示，在0～8 h时，GN6生长速率最快，显著高于其他处理（Plt;0.05），GN8和GN9生长速率最慢，显著低于其他处理（Plt;0.05），除GN8和GN9外其它菌株均处于对数生长期，GN9菌株在8～12 h时处于对数生长期，GN8菌株在12～16 h时处于对数生长期；在20 h时菌株GN1，GN3，GN5，GN6和GN10生长速率达到最高，菌株GN1，GN3，GN6和GN10生长速率较快显著高于其他菌株（Plt;0.05），GN2菌株生长速率最慢显著低于其他处理（Plt;0.05）；在24 h时，菌株GN1，GN3，GN6，GN7和GN10生长速率较快显著高于其他处理（Plt;0.05），GN2菌株和GN5菌株生长速率较慢，显著低于其他处理（Plt;0.05），GN1菌株和GN3菌株生长速率相较20 h时没有发生变化，菌株GN5，GN6和GN10生长速率相较20 h时降低，菌株GN1，GN3，GN5，GN6和GN10生长速率接近饱和处于生长稳定期。

耐低温乳酸菌在35℃下的生长速率如表6所示，在4～8 h时10株菌株均处于对数生长期，GN10菌株生长速率最高，显著高于其他菌株（Plt;0.05），GN9生长速率最低，显著低于其它菌株（Plt;0.05）；在8～16 h时，菌株GN10和GN1生长速率显著高于其它菌株（Plt;0.05），GN4菌株生长速率显著低于其它菌株（Plt;0.05）；在16～24 h，菌株GN1，GN2，GN3，GN6，GN7，GN8和GN10生长速率显著高于其它菌株（Plt;0.05），24 h时菌株GN1，GN3，GN5，GN6，GN8和GN10生长速率相较于20 h降低，表明生长速率接近饱和处于生长稳定期。

2.4" 耐低温乳酸菌16S rDNA同源性序列分析

经16S rDNA测序及同源性分析发现，本试验中筛选出的耐低温乳酸菌分属植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌和清酒乳杆菌四个种，GN1，GN3和GN10与植物乳杆菌相似度最高，GN2，GN4和GN7与短乳杆菌相似度最高，GN5和GN6与弯曲乳杆菌相似度最高，GN8和GN9与清酒乳杆菌相似度最高。

3" 讨论

温度对微生物生长繁殖的影响是决定青贮品质的重要因素［22］。乳酸菌是青贮过程中的主导微生物，低温不利于乳酸菌的生长和繁殖，乳酸菌的生长温度是5～55℃，适宜生长温度为30～40℃［23］，适宜的温度促使乳酸菌代谢所需的酶呈现出较高的活性，使得乳酸菌最大程度地产生有机酸。Guchte等［24］研究发现，乳酸菌对温度变化具有较好的适应性，最适宜温度为20～45℃，与Zhang等［5］研究发现青贮适宜温度为20～40℃相吻合，说明温度对乳酸菌发酵性能的影响和温度对青贮品质的影响相互关联，分离筛选耐低温乳酸菌可以提升青藏高原地区低温青贮饲料的青贮品质［25］。

本次试验中筛选出菌株GN1，GN3，GN5，GN6，GN7，GN10在5℃低温条件下均可正常生长，其余菌株微弱生长，10株菌株在10℃温度条件下均可正常生长，该研究结果与蔺豆豆等［26］从青藏高原燕麦中分离耐低温乳酸菌结果相似，而张红梅［27］从青藏高原垂穗披碱草中筛选出的耐低温乳酸菌在4℃低温条件下完全不能生长，10℃温度条件下微弱生长，研究结果与本结果不同，可能因为不同种牧草中分离出乳酸菌生长能力存在差异。筛选出的10株乳酸菌中有7株同型乳酸菌和3株异型乳酸菌，3株同型乳酸菌展现出较强的耐低温能力和产酸能力，只有1株异型乳酸菌具有良好的耐低温能力，多数同型发酵乳酸菌产酸能力强于异型发酵乳酸菌，这与Olstorpe等［28］研究结果相似。菌株GN1，GN3，GN6，GN7和GN10在15℃，25℃和35℃三个温度条件下均表现出较强的生长能力，且在产酸试验中表现出较强的产酸能力，该研究结果与储徐建等［29］研究结果相似，说明产酸能力与生长能力为正相关关系。10株菌株在15℃条件下生长速率低于25℃和35℃，且菌株进入对数生长期所需时间也随着温度的降低而延长，这与崔美岩［30］研究结果相似，说明低温对乳酸菌的生长和繁殖有抑制作用。

10株菌株经过16S rDNA测序比对分析后发现，菌株GN1，GN3和GN10与植物乳杆菌相似度最高，菌株GN2，GN4和GN7与短乳杆菌相似度最高，菌株GN5和GN6与弯曲乳杆菌相似度最高，菌株GN8和GN9与清酒乳杆菌相似度最高。结合碳源发酵试验、同源性测序分析和前人研究结果可知［31］，菌株GN2，GN4和GN7同为Levilactobacillus brevis strain，菌株间同源性相似度较高，但GN7菌株与蔗糖和甘露醇发生微弱反应，GN2和GN4菌株则不发生反应，同时GN7菌株耐低温能力和产酸能力也强于GN2和GN4菌株，此结果与Somashekaraiah等［32］研究结果相似，说明同源性相似度较高的不同来源乳酸菌中存在差异。菌株GN1，GN3和GN10同为植物乳杆菌且均具有较强的耐低温能力和产酸能力，同时能够发酵的碳源也多于其他菌株，适宜作为青贮添加菌剂，与张慧杰等［33］研究结果相似。菌株GN7为短乳杆菌，耐低温能力和产酸能力较强，且异型发酵乳酸菌可以提高青贮饲料开窖后有氧稳定性，减少有氧发酵提升青贮品质［34］，适宜作为异型发酵乳酸菌添加剂。综上，菌株GN1，GN3，GN7和GN10适宜作为青藏高原地区低温青贮乳酸菌添加剂的潜力菌株。

4" 结论

从甘南地区三种青贮牧草中初步纯化得到42株乳酸菌，进行低温生长试验和产酸试验筛选得到10株耐低温乳酸菌，10株菌株均表现出较好的耐低温、耐酸和耐盐能力，其中7株为同型乳酸菌，3株为异型乳酸菌。对10株菌株进行生理生化测定、不同温度生长测定、产酸试验和16S rDNA同源性测序分析，最终得到的10株菌株中3株为植物乳杆菌，3株为短乳杆菌，2株为弯曲乳杆菌，2株为清酒乳杆菌。综合考虑菌株的耐低温能力、产酸能力、生理生化性质和生长速率，植物乳杆菌GN1，GN3和GN10，短乳杆菌GN7可以作为青藏高原地区低温青贮添加剂的添加菌株。

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（责任编辑" 闵芝智）