非生物胁迫对拟南芥IQM4基因表达的影响

萧文慧　宋俊威　黄小玲　周玉萍　田长恩

【摘 要】本文首先以拟南芥IQM4基因为搜索对象，检索了两个生物信息数据库，搜索到IQM4基因对几种非生物胁迫均能产生应答，并对IQM4基因表达量进行了分析；然后参考数据库所提供的实验方法，采用半定量RT-RCR技术验证了几种非生物胁迫对IQM4基因表达的影响。结果表明盐和渗透胁迫均能抑制幼苗期IQM4基因表达，而脱水、低温和机械损伤早期能增强IQM4基因表达水平。实验初步证明拟南芥IQM4基因在植物非生物胁迫中发挥重要作用。

【关键词】拟南芥；IQM4；非生物胁迫；基因表达

在植物信号转导途径中，Ca2+作为动植物细胞内重要的第二信使，通过Ca2+传感蛋白及其靶蛋白来调节多种生化和细胞反应。钙调素（Calmodulin，CaM）是目前最重要的一类胞内Ca2+信号受体。在众多的CaMs中，除CaM7具有转录调控活性外，其它均无任何酶活性，必需与其下游的靶蛋白—钙调素结合蛋白（calmodulin-binding protein， CaMBP）来调节细胞生理功能[1]。

植物中有5个含IQ基序的钙调素结合蛋白家族：IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA，其中IQM家族由我们发现[2]。拟南芥IQM家族共有6个成员，均含1个IQ基序，N-端具有与豌豆重金属诱导蛋白6A的同源序列，C-端具有与天花粉素的同源序列。IQM1编码1个Ca2+不依赖型的CaMBP，影响保卫细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，在气孔运动中发挥重要作用，IQM1缺失抑制了光诱导的气孔张开，iqm1突变体表现气孔开度小和根较短的表型[3]；IQM1过表达株系则表现为气孔开度大和根较长[4]。IQM4（编号为At2g26190）是IQM家族中与IQM1高度同源的成员[5]，其功能未见报道。为了研究IQM4的基因功能，本文以IQM4基因为搜索对象，检索了两个生物资源信息数据库，搜索到IQM4基因对几种非生物胁迫均能产生应答；为了验证生物信息数据库中IQM4基因表达的数据，本文开展了盐、甘露醇、脱水、低温以及损伤处理对IQM4基因表达影响的分析，该研究结果为进一步开展IQM4基因的功能研究提供重要理论依据。

1 实验材料

实验所用的拟南芥（Arabidopsis thaliana）为Columbia（Col）生态型。MS盐购自Sigma公司，PrimeScript One Step RT-PCR Kit，RNAiso Plus购自TaKaRa公司，NaCl和Manntiol试剂购于上海生工。

2 实验方法

2.1 拟南芥培养

土壤培养：将经过4℃浸泡3d的吸涨种子直接点种于营养土表面，置于长日照培养室中培养（温度为22±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为100μmol·m-2·s-1，相对湿度为85%，下同）。

1/2MS培养基培养：取经过4℃浸泡3d的吸涨种子，用75%乙醇浸泡5～10s后弃乙醇，再加入0.1% HgCl2浸泡5min后弃HgCl2，用无菌水漂洗3～4次。最后加入适量的0.3% Agar溶液悬浮，接种到1/2MS培养基上，置于长日照培养室中培养。

2.2 生物信息学数据库的检索

以IQM4基因为搜索对象，检索AtGenExpress Visualization Tool（http：//jsp.weigelworld.or）和Genevestigator Expression Data（https：//www.genevestigator.com），以基因表达改变量为1.5倍为阈值，筛选对IQM4基因表达影响较大的非生物因素作为后续实验的依据。

2.3 非生物胁迫的处理

渗透胁迫处理：将1/2 MS固体培养基上生长2周的幼苗小心拔出，需保持幼苗的根的完整性，称取30～50mg幼苗为一个样品，共称取6个样品；将样品浸没于300mmol/L甘露醇溶液中，分别在0.5、1、3、6、12和24h取样。

盐胁迫处理：称取6个2周幼苗样品，将样品浸没于150mmol/L氯化钠溶液中，分别在0.5、1、3、6、12和24h取样。

低温处理：称取3个2周幼苗样品；将样品置于4℃处理，分别在0.5、1和3h取样。

脱水处理：称取3个2周幼苗样品；将样品放在滤纸上，并置于长日照培养室中，分别在0.5、1和3h取样。

损伤处理：先用带有锯齿的镊子夹伤生长在培养基上的2周幼苗，然后置于长日照培养室中，分别在0.25和0.3h取样。

2.4 IQM4基因的RT-PCR分析

参照RNAiso Plus说明书提取非生物胁迫处理的样品总RNA。

以IQM4编码序列的特异引物F1：5-AGTTAGCTC TTCAGCATTGGC-3′和R1：5-TCTTCTTGTTCCTCTGTAACG-3′进行半定量RT-PCR，分析样品中IQM4的表达水平。实验以拟南芥β-ATPase基因设计了内标引物F2：5-CTGAATCAATCTCTTAAGCTG-3和R2：5-GTGCAGA AAGTTCTACAGAACTAC-3。RT-PCR采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit，每个反应以100 ng总RNA为模板，总反应体积为20 μL，扩增参数为①50℃ 30min，②94℃ 2min，③94℃ 30s，④54℃ 30s，⑤72℃ 40s，③④⑤ 31次循环，⑥72℃ 5min。反应结束后，取扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并用凝胶成像系统拍照保存。

3 结果与分析

3.1 生物信息数据库中IQM4基因表达数据分析

本文以拟南芥IQM4为研究对象，检索了两个数据库，搜索到大量IQM4基因表达的数据资料。表1是以IQM4表达量改变倍数在1.5倍以上为标准，整理了幼苗地上组织中IQM4基因表达受到盐和渗透胁迫、低温、脱水以及机械损伤等非生物胁迫因子影响的数据。从数据库的资料（表1）来分析，盐胁迫1h后明显抑制了幼苗地上组织中IQM4基因表达；渗透胁迫在0.5～1h内显著增强了IQM4基因表达量，但3～24h内基因表达变化不明显；低温胁迫0.5h内IQM4基因表达量有所下调；脱水和机械损伤能迅速增强IQM4基因表达量。

3.2 幼苗中IQM4基因的RT-PCR分析

采用半定量RT-PCR技术分析几种非生物胁迫对拟南芥幼苗中IQM4基因表达的影响。

从图1A可以看出，与对照相比，盐胁迫初期（0.5和1h），IQM4基因表达明显上调，随着盐胁迫时间的增加（6和12h），IQM4表达量显著降低，但24h后表达量恢复到对照水平。图1B显示，与对照相比较，渗透胁迫0.5～12h期间IQM4表达量逐渐降低，至24h时表达量有所增加，但仍低于对照水平。图1C显示脱水处理能增强幼苗中IQM4基因表达量。图1D显示低温处理后，IQM4表达水平呈现先降低（0.5～1h）后升高（3h）趋势，低温处理3h后IQM4表达量明显高于对照。图1E显示幼苗遭受机械损伤0.25h后，IQM4基因表达稍有增强，而0.5h后，IQM4基因的表达量急剧降低。从RT-PCR结果来看，不同胁迫因子对幼苗中IQM4基因表达水平产生了不同影响。

4 讨论

已知拟南芥IQM家族在植物对光、生物和非生物胁迫反应中发挥重要作用[7]。半定量RT-PCR结果验证了生物信息数据库的资料，结果表明拟南芥IQM4基因表达受到盐和渗透胁迫、脱水、低温和机械损伤等非生物胁迫因子的影响，初步证明IQM4基因在植物非生物胁迫中发挥重要作用。

实验发现RT-PCR分析结果与数据库的数据有部分偏差，如盐胁迫处理RT-PCR结果是胁迫0.5h和1h后IQM4基因表达明显上调，而数据库的资料则为胁迫1h后IQM4表达量显著降低。RT-PCR结果显示渗透胁迫明显抑制IQM4表达，而数据库的资料则为渗透胁迫0.5h和1h后显著增强IQM4基因表达量。数据库的资料显示机械损伤明显增强IQM4表达水平，但RT-PCR结果则是表达水平有所下降。我们推测RT-PCR结果与数据库的资料出现偏差的原因可能是因为实验材料的取样部位不一致造成的，数据库数据的取材为幼苗地上组织，而本实验是以整株幼苗为实验材料。

【参考文献】

[1]韦慧彦，郭振清，崔素娟.钙不依赖性钙调素结合蛋白的研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2007，34（2）：124-131.

[2]田长恩，周玉萍.植物具IQ基序的钙调素结合蛋白的研究进展[J].植物学报，2013，48（4）：447-460.

[3]Zhou YP， Duan J， Yamamoto KT， Tian CE. AtIQM1， a novel calmodulin-binding protein， is involved in stomatal movement in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology， 2012， 79（5）： 333-346.

[4]周玉萍，陈琼华，陈洁珊，程惠贞，田长恩.IQM1基因过量表达对拟南芥气孔运动及根系生长的影响[J]. 西北植物学报，2013，33（5）：904-910.

[5]Zhou YP， Chen YZ， Duan J，Yamamoto KT， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2010， 32（1）： 191-198.

[责任编辑：杨玉洁]