基因芯片在胃癌及肿瘤球细胞差异表达基因筛选中的应用

许乙威+贾举闻+简锋

【摘要】 目的 探讨基因芯片在胃癌及肿瘤球细胞差异表达基因筛选中的应用价值。方法 在无菌条件下， 对人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞进行体外培养， 对两种细胞的总RNA进行提取， 并实施纯化处理。对总RNA做杂交处理， 采用TreeViem及Cluster软件分析及显示所得荧光信号。结果 根据差异显示性标准， 对照人胃癌细胞， 显示肿瘤球细胞中， 有1746条差异表达基因。其中， 基因表达上调608个， 基因表达下调1138个， 且涉及方面较多， 包括肿瘤形成、信号传导、细胞生长等。结论 人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞具有一定基因表达差异， 基因芯片筛选价值较高， 且肿瘤形成在肿瘤球细胞变化中发挥着重要的作用， 需引起高度关注。

【关键词】 基因芯片；胃癌细胞；肿瘤球细胞；基因表达

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.30.076

作为临床上一种常见恶性肿瘤， 胃癌患病率较高。以往， 临床上多采用手术、化疗、放疗、中药等方法进行治疗， 但病死率仍较高[1]。近年来， 基因芯片技术在胃癌的基础研究领域得到广泛应用， 能随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式， 可为治疗胃癌提供新的思路[2]。本研究采用基因芯片技术， 对人胃癌细胞及其肿瘤球细胞的差异表达基因进行筛选， 从而寻找新的治疗胃癌的途径， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 本研究所用材料包括购自中科院细胞库的人胃癌细胞HGC-27；购自Gibco公司的胰蛋白酶；购自Sigma公司的hechst33342；购自Invitrogen公司的表皮生长因子、DMEM、DMEM/F12等。

1. 2 有血清培养液的培养 以100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、含%胎牛血清的DMEM培养液， 将HGC-27于5%二氧化碳、37℃条件下进行培养， 及时对培养液进行更换， 消化传代采用0.25%胰蛋白酶进行。

1. 3 无血清培养液的培养 以无血清、含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、20 ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12培养液， 将HGC-27接种到低吸附塑料6孔板中， 在5%二氧化碳、37℃条件下进行培养， 对肿瘤球形成情况进行观察， 每日增加200 μl新鲜培养液。

1. 4 提取总RNA 人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞的总RNA提取采用Trizol试剂进行， 并做纯化处理， RNA质量采用甲醛变性胶电泳进行检测。

1. 5 基因表达谱芯片杂交 采用GeneChip IVT Eepress Kit进行， 严格按照说明书进行操作， 从而合成每个样品的cRNA。将基因芯片与标记的cRNA进行杂交。

1. 6 收集与分析芯片图像 对基因芯片实施洗涤与染色处理， 微阵列扫描采用基因芯片扫描仪3000进行， 对芯片图像进行收集， 对数据进行读取。样品间基因转录差异分析采用校正后的原始数据完成。

2 结果

2. 1 肿瘤球培养及总RNA提取 在SSM培养液中， 细胞呈现均匀贴壁生长状态。在SFM培养液中培养7 d， 细胞呈现致密肿瘤球状态。实施甲醛凝胶电泳， HGC-27及肿瘤球细胞的RNA电泳条带清晰， 提示总RNA完整无降解， 可实施芯片实验。

2. 2 基因表达谱芯片杂交 将基因芯片与标记的cRNA进行杂交， 芯片上各位点信号强度采用扫描仪3000进行明确。而HGC-27细胞及肿瘤球细胞中各基因表达水平均能经由芯片上各位点信号强度进行反映。

2. 3 芯片图像采集及数据分析 经由计算机对杂交点荧光信号强度进行定性、定量处理， 根据差异显示性标准对照人胃癌细胞， 肿瘤球细胞中， 有1746条差异表达基因。其中， 基因表达上调608个， 基因表达下调1138个。而肿瘤球细胞中表达上调10倍以上的基因包括TDO2、GDF15、EGR1、DUSP6、ETV5、PHLDB2、MAFF、TRIB3、COL1A2、CREB5、TOX、EMP1、AKR1C3、ELK3、PROCR、LRRC4B、SHOX2等。肿瘤球细胞中表达下调10倍以上的基因包括TMEFF2、SFRP4、GRIK3、CHODL、CNR1、CNTN1、IGFBP5、EDNRA、AMBN、SEPP1、KBTBD10、DCT等。而且， 基因表达的变化涉及方面较多， 包括肿瘤形成、信号传导、细胞生长等。

3 讨论

现阶段， 随着人类基因组计划的不断深入， 研究重点逐步过渡到后基因组时代[3]。早在20世纪， 美国学者发现基因芯片， 认为芯片DNA与样品cDNA结合被标记， 能对细胞所有基因进行描述， 且能对与某些生命现象相关的基因表达进行了解和掌握， 在基因调控研究中有着较高的应用价值[4]。此外， 基因芯片技术还能对生物样本所有基因的表达水平进行检测， 从而获得基因组水平的基因表达谱数据[5]。经由分析这些数据， 能对基因功能及基因之间的相互作用进行了解和掌握[6]。

本研究采用基因芯片技术， 对人胃癌细胞及其肿瘤球细胞的差异表达基因进行筛选， 从而寻找新的治疗胃癌的途径。结果显示， 根据差异显示性标准， 对照人胃癌细胞， 肿瘤球细胞中， 基因表达上调608个， 基因表达下调1138个， 且涉及方面较多， 包括肿瘤形成、信号传导、细胞生长等。考虑到存在较多的差异基因， 故本研究仅重点对差异在10倍以上的基因进行分析。结果发现， GDF15、ETV5等与肿瘤形成及转移相关的基因表达明显上调。同时， TMEFF2、IGFBP5等可抑制肿瘤形成的基因表达明显下降。结果表明， 在肿瘤形成过程中， 肿瘤球细胞变化发挥着重要的作用。这都能为临床研究胃癌发病机制提供一定的参考价值， 有利于深入分析胃癌分子诊断标志、药物作用靶标等， 临床价值较高。

综上所述， 人胃癌细胞HGC-27及其肿瘤球细胞具有一定基因表达差异， 基因芯片筛选价值较高， 肿瘤形成在肿瘤球细胞变化中发挥着重要的作用， 需引起高度关注。

参考文献

[1] 时伟红， 于岳宝， 李兆阳， 等. 基因芯片筛选胃癌及肿瘤球细胞差异表达基因. 现代肿瘤医学， 2012， 20（5）：905-908.

[2] Shi WH， Yu YB， Li ZY， et al. Screening for genes that are differentially-expressed between gastric cancer cells and gastric tumor sphere cells using the gene chip technique. Genetics & Molecular Research Gmr， 2015， 14（4）：14893-14899.

[3] Shi W， Yuebao YU， Zhaoyang LI， et al. Differential expression gene of human gastric cancer line HGC-27 cells and its tumor sphere cells screened by gene chip technique. Journal of Modern Oncology， 2012， 25（12）：1363-1365.

[4] 赵路， 杨娟， 于婧， 等. 食管鳞癌组织及周围正常食管黏膜组织差异表达基因的筛选. 世界华人消化杂志， 2011， 19（22）： 2328-2333.

[5] 曹明楠， 崔俊， 李卫东. 基因芯片技术在抗肿瘤药物研究和肿瘤诊断中的应用. 中国药理学与毒理学杂志， 2014， 28（6）：932-938.

[6] 王珊珊， 廖清船， 许静， 等. 基因芯片技术在中药肿瘤药理研究中的应用. 中国药房， 2011， 22（31）：2968-2970.

[收稿日期：2016-10-20]