αB—crystallin在喉癌组织中的表达及临床意义

熊林等

[摘要] 目的 探讨αB-crystallin基因在喉癌组织中的表达及其与喉癌的关系。 方法 收集2008年3月～2014年10月南京医科大学第二附属医院及皖南医学院弋矶山医院手术切除的喉癌标本54例及13例癌旁正常黏膜标本，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测8例喉癌组织及其癌旁正常组织中αB-crystallin基因的表达，免疫组化法检测54例癌组织及13例癌旁正常组织中αB-crystallin蛋白的表达，比较不同组织中αB-crystallin阳性表达率。 结果 喉癌组织中的αB-crystallin mRNA表达量及αB-crystallin蛋白阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；不同TMN分期及淋巴结转移情况的喉癌组织中αB-crystallin蛋白的阳性表达率比较差异有统计学意义（P < 0.05），不同性别、年龄、肿瘤分型及分化程度的喉癌组织中αB-crystallin蛋白的阳性表达率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 αB-crystallin基因的高表达与喉癌发生发展及转移有关，可能为喉癌患者的预后提供一个潜在的风险评估指标。

[关键词] αB-crystallin；实时荧光定量PCR；喉癌；免疫组化

[中图分类号] R739.63 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）10（a）-0009-04

Expression and significance of αB-crystallin in laryngeal squamous cell carcinoma

XIONG Lin1 MAO Yuan2 MA Jun3 ZHANG Dawei4▲ ZHU Jin5 CHEN Renjie4

1.Department of Pathology， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， Jiangsu Provincial Official Hospital， Jiangsu Province， Nanjing 210024， China； 3.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， Yiji Shan Hospital of Wannan Medical College， Anhui Province， Wuhu 241001， China； 4.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 5.Military Medical Research Institute of Nanjing Military Region， Jiangsu Province， Nanjing 210002， China

[Abstract] Objective To examine the expression of αB-crystallin in human laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC） and investigate the relationship between its expression and LSCC. Methods A total of 54 cases of LSCC and 13 cases of adjacent normal tissues were collected from the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University and Yiji Shan Hospital of Wannan Medical College from March 2008 to October 2014. Real-time quantitative polymerase chain reaction （8 LSCC tissues， 8 adjacent normal tissues） and immunohistochemistry （54 LSCC tissues and 13 adjacent normal tissues） were performed to detected the expression of αB-crystallin gene and protein in LSCC. The positive expression rate of αB-crystallin in different tissues was compared. Results The positive expression rate of αB-crystallin mRNA and protein in LSCC were significantly higher than those in tumor-adjacent normal tissues， the differences were statistically significant （P < 0.01）. the positive expression rate of αB-crystallin in LSCC with different pTNM stage and lymph node metastasis status had statistically significant difference （P < 0.05）； while， there was no statistically significant difference in the positive expression rate of αB-crystallin in LSCC with different gender， age， tumor classification and differentiation （P > 0.05）. Conclusion The data suggest that αB-crystallin expression is correlated with malignant phenotypes of LSCC and it may serve as a novel prognostic factor for LSCC.

[Key words] αB-crystallin； Real-time PCR； Laryngeal squamous cell carcinoma； Immunohistochemistry

鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是头颈部的最常见的恶性肿瘤，占发展中国家所有疾病的1/4。在所有头颈部恶性肿瘤中有近90%是鳞状细胞癌[1]。在这其中，又有约1/4的头颈部癌是喉癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）。喉癌是喉部上皮起源的恶性肿瘤，临床症状通常取决于肿瘤原来的位置和大小[2-3]。近年来喉鳞状细胞癌治疗策略已经取得了一些进展，但是治疗效果仍然不是十分满意，喉癌死亡率仍较高，5年存活率仅64%[4]。因此，迫切需要寻找一种新颖而有价值的靶标志提示患者的预后或早期复发的风险从而指导治疗[5]。

αB-crystallin属于小热休克蛋白家族（HSP20）的成员之一，最早发现于眼部，早期研究对其在晶状体、心肌和骨骼肌功能的影响研究较多。现阶段的研究发现αB-crystallin具有对细胞的保护及抗凋亡作用的双重功能[6]。最近的资料还显示，多种实体瘤上αB-crystallin的表达异常，如头颈部肿瘤、口腔鳞癌、非小细胞肺癌以及乳腺基底细胞样癌，且这种异常表达与肿瘤的发生、发展和预后有相关性[7-10]。本文通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测及免疫组化方法检测αB-crystallin基因在喉癌和癌旁正常组织中的表达差异，初步探讨其与喉癌的发生发展以及浸润转移的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

收集2008年3月～2014年10月南京医科大学第二附属医院及皖南医学院弋矶山医院喉癌手术切除的标本54例，同时选取13例距离肿瘤2 cm以上的癌旁喉黏膜组织作为对照，病理证实均为正常喉黏膜。其中8例癌组织及其远端正常组织在取标本后立即置液氮中保存。54例喉癌患者中，男48例，女6例；年龄42～81岁，平均（60.4±11.54）岁；声门型43例，声门上型8例，声门下型3例；组织病理学分级：高分化23例，中低分化31例；伴淋巴结转移30例，不伴淋巴结转移24例；临床分期及组织病理学分级按2002年国际抗癌协会（UICC）TMN分类标准及组织病理学分级标准第4版第二次修订方案：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期26例。术前患者均未经任何治疗，经病理确诊为喉鳞状细胞癌，且均知晓并同意参与本研究。本研究已经南京医科大学第二附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

Trizol试剂盒（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（Promega公司），αB-crystallin上游引物：5'-CTTTGA CCAGTTCTTCGGAG-3'，下游引物：5'-CCTCAATCACATCTCGCTGT-3'；β-actin上游引物：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物：5'-GCTGCTACCTT CACCGTTCC-3'。所有引物序列均由上海英俊生物工程有限公司提供。鼠抗人αB-crystallin单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，USA）；二步法免疫组化试剂和PV-9000（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）

按照试剂盒的说明提取总RNA，具体步骤见说明书，提取的总RNA置于-20℃冰箱保存备用。逆转录反应体系（20 μL）中加入适量总RNA（2 μL），70℃ 5 min，冰水冷却后加入逆转录buffer及逆转录酶37℃孵育1 h，然后升温至95℃灭活5 min，立即冰浴，-20℃保存备用。然后进行PCR扩增，在25 μL PCR反应体系中加入cDNA 5 μL及引物，扩增条件：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸45 s。循环30次。最后72℃延伸10 min，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。分别取5 μL PCR产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，对凝胶进行灰度扫描及照像。Real-time PCR实验使用SYBR荧光染料，在ABI PRISMR7000荧光定量PCR仪（Perkin-Elmer，Foster City，CA，USA）上设置实时定量PCR（QPCR）的反应条件50℃孵育2 min，95℃预变性10 min；94℃变性15 s，循环40 次，56℃退火1 min。

1.4 免疫组织化学染色

本研究中54例喉癌及13例正常组织福尔马林处理后石蜡包埋，切片后采用两步法对所有标本切片进行免疫组化染色，检测各组标本的αB-crystallin蛋白表达情况，具体操作参照试剂盒说明进行，染色结果判定：由2名独立的病理科医师采用半定量积分法阅片，结果由染色强度和染色密度或阳性细胞率决定，观察10个视野（200倍），将染色强度分为4级进行评分，0分：无染色，1分：淡黄色，2分：棕黄色，3分：棕褐色；计算阳性细胞率，根据阳性率进行评分，1分：阳性率<10%，2分：阳性率为10%～<50%，3分：阳性率为50%～<80%，4分：阳性率为80%～100%。最后评分=染色强度评分×阳性率评分，0～3分为阴性，>3分为阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 αB-crystallin基因表达

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测见一特异扩增条带，其分子量大小与αB-crystallin预期结果（230 bp）相符（图1），β-actin作为内参。QPCR检测结果显示αB-crystallin基因在喉癌组织中mRNA表达水平（5.398±0.882）明显高于正常喉组织（2.195±0.534），差异有高度统计学意义（t = 6.942，P < 0.01）。

2.2 αB-crystallin蛋白表达

αB-crystallin蛋白主要表达在细胞质中，染色呈弥漫性颗粒状。在鳞癌组织中癌巢的染色较强，部分见核染，在正常上皮组织中不表达或表达较弱（图2）。54例喉癌组织中有39例阳性，15例阴性。正常黏膜组织标本中11例呈阴性表达，2例阳性表达，两组比较差异有高度统计学意义（χ2 = 14.254，P < 0.01）。不同性别、年龄、肿瘤分型及分化程度的喉癌组织中αB-crystallin蛋白的阳性表达率比较差异无统计学意义（P > 0.05）；不同TMN分期及淋巴结转移情况的喉癌组织中αB-crystallin蛋白的阳性表达率比较差异均有统计学意义（χ2 =6.591、10.634，均P < 0.05），Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移喉癌组织染色强度显著高于Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移者。

3 讨论

αB-crystallin作为一种热稳定性良好的蛋白，具有分子伴侣的作用，能帮助蛋白质的正确折叠、移位、复性和降解，同时能够抑制DNA损伤药物、TNF和Fas蛋白等诱导的细胞凋亡作用[11-12]，使得它在肿瘤发生发展及预后中起着重要作用[13-16]。

本研究发现，喉癌组织中的αB-crystallin mRNA表达水平明显高于癌旁正常组织，免疫组化结果也显示喉癌组织中αB-crystallin蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常组织，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），与αB-crystallin在其他肿瘤中的研究结果一致[7-10]。可能是由于αB-crystallin可以通过内在的线粒体途径和外在的凋亡受体阻断细胞凋亡的信号传递，抑制了细胞的凋亡，从而有促进肿瘤的形成[6]。本研究发现αB-crystallin Ⅲ～Ⅳ期喉癌组织的染色强度显著高于Ⅰ～Ⅱ期，可能机制为αB-crystallin的表达促进上皮细胞恶性转化，并使肿瘤细胞进一步恶性增殖，同时使肿瘤细胞易于迁移侵袭[6]。本研究中，有淋巴结转移的喉癌组织中αB-crystallin蛋白阳性表达率明显高于无淋巴结转移者，提示αB-crystallin也有促癌生长及肿瘤转移的特性，最近的文献也进一步支持了这种结论[6]。但是，也有研究显示，αB-crystallin在一些头颈部肿瘤中表达下降或缺失，如甲状腺癌、鼻咽癌[17-18]，这些研究提示了αB-crystallin基因在某些肿瘤发病机制中可能发挥着肿瘤抑制的作用。Chin等[5]研究发现头颈癌肿瘤组织有αB-crystallin基因过表达现象，其过表达与预后呈明显负相关，且其中19例αB-crystallin过表达但无淋巴结转移的患者中有7例复发，提示αB-crystallin可能具有潜在的、较淋巴结转移更有意义的患者预后的评估指标。本研究病例数较少，期待在后续的研究中对αB-crystallin及喉癌预后作出更有意义的评估。

目前，喉癌的治疗手段包括分子靶向治疗、基因治疗以及免疫治疗。然而没有一种治疗方法起到令人满意的治疗效果。近年来的研究也发现了一些喉癌的分子靶标[19-20]，因此，找到一种预后靶标对于喉癌治疗和预防更加重要。而αB-crystallin的高表达在喉癌的发生发展过程中可能会产生重要的作用。这或许可以为喉癌的治疗提供一个潜在的靶标。

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（收稿日期：2016-06-30 本文编辑：任 念）