白木香转录因子AsMYB1和AsMYB2克隆及表达分析

冯莹莹　董先娟　刘晓　闫雅如　王金铃　史社坡++王晓晖　屠鹏飞

[摘要] MYB类转录因子是数量最多、功能最多样化的转录因子家族之一。该研究根据白木香转录组高通量测序结果设计引物扩增白木香中MYB基因，利用RTPCR技术从白木香中首次克隆得到2个MYB基因cDNA 全长，分别命名为AsMYB1，AsMYB2，并对MYB蛋白质进行跨膜结构分析和聚类分析，预测其生物学信息；利用实时荧光定量PCR技术检测 AsMYB基因在不同组织， 及在NaCl、低温（4 ℃）、重金属（CdCl2）、干旱（甘露醇）4种非生物胁迫和脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4种外源激素处理下的表达差异。该研究中克隆获得的AsMYB1基因全长1 063 bp，编码353个氨基酸；AsMYB2基因全长1 081 bp，编码359个氨基酸。2个基因具有组织表达特异性；AsMYB1，AsMYB2 基因的转录水平受到不同生物胁迫和外源激素的影响，说明MYB基因对白木香防御反应和激素信号传导具有重要的作用。

[关键词] 白木香； MYB基因； 表达分析； 非生物胁迫； 激素处理

Cloning and expression analysis of transcription factor AsMYB1 and

AsMYB2 from Aquilaria sinensis

FENG Yingying， DONG Xianjuan， LIU Xiao， YAN Yaru， WANG Jinling， SHI Shepo， WANG Xiaohui*， TU Pengfei*

（Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] The MYB gene family comprises one of the richest groups of transcription factors in plants. The full length of two MYB genes were isolated through heterologous screening of Aquilaria sinensis calli transcriptome data， and the reverse transcription PCR was performed to obstain the corrected MYB clones， named AsMYB1， AsMYB2. The MYB transmembrane domain and phylogenetic analysis were predicted by different software to analyze the bioinformatics of MYB proteins. The transcript level of AsMYB1， AsMYB2 was performed by realtime quantitative RTPCR in different tissues and in responds to abiotic stresses including salt， cold， metal and drought stress， and hormone treatments including abscisic acid （ABA）， salicylic acid （SA）， gibberellins （GA3） and methyl jasmonate （MeJA） treatment. The AsMYB1 cDNA sequence had an ORF of 1 063 nucleotides， encoding a protein of 353 amino acids. The largest AsMYB2 ORF was 1 081 nucleotides， and its predicted translation products consisted of 359 amino acids. Two MYB genes had a tissuesspecific pattern in A. sinensis. Moreover， the expression level of AsMYB1 and AsMYB2 was regulated by different abiotic stresses and hormone treatments， suggesting the transcription factors AsMYB1 and AsMYB2 play an important role in plant defense and hormone signal transduction in A. sinensis.

[Key words] Aquilaria sinensis； MYB transcription factor； expression analysis； abiotic stress； hormone treatment

轉录因子（transcription factor， TF）也称反式作用因子，是一类能够与基因启动子区域中顺式作用元件、沉默子或增强子发生特异性结合并相互作用，从而激活或者抑制目的基因转录和翻译的DNA结合蛋白。DNA 结合区域的特点可将转录因子分为若干个家族，其中，MYB（myeloblastosis）转录因子蛋白是包含 MYB 结构域且数量众多、功能多样的一类蛋白家族成员[1]，它们在植物的生长发育、次生代谢、激素信号转导和植物的非生物胁迫反应中起到重要的作用。对MYB基因克隆和功能进行研究，有利于丰富植物的防御反应机制和信号转导机制的研究。endprint

白木香Aquilaria sinensis（Lour.） Gilg又名土沉香，为瑞香科沉香属植物， 是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一正品植物来源，现已被列为国家二级濒危保护植物。白木香的主要产地为广东、海南、广西、福建等省区[2]。沉香是白木香含有黑色树脂的的木材，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘的功效，可用于治疗胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虛气逆喘急[3]。白木香在健康状态下不能够结香，而受到自然因素（雷劈、火烧、微生物入侵等）或人为因素（砍伤、打洞、接菌等）的作用渐渐形成沉香，但是物理伤害和化学伤害诱导沉香形成的分子机制一直没有清晰揭示，严重制约了高效结香技术的建立[4]。植物在感受逆境胁迫时，通过一系列转录因子及其他顺式作用因子的协同作用，使植株体内发生一系列的生理生化反应，从而抵御或减轻不良环境造成的危害[5]。而MYB 转录因子广泛分布于高等植物中，是植物中最大的转录因子家族之一，因此研究MYB转录因子的结构与表达可为白木香结香机制和植物防御机制的阐明奠定基础。本研究利用RTPCR技术，从白木香愈伤组织中成功获得了2个MYB基因的全长序列；利用实时荧光定量PCR检测2个MYB基因在不同组织及NaCl、低温（4 ℃）、重金属（CdCl2）、干旱（甘露醇）4种非生物胁迫和脱落酸（abscisic acid，ABA）、水杨酸（salicylic acid，SA）、赤霉素（gibberellin，GA3）、茉莉酸甲酯（methyl Jasmonate，MeJA）4种外源激素处理下的表达差异，对进一步研究沉香结香机制及丰富植物的防御反应机制有十分重要的意义。

1 材料

利用北京中医药大学栽培的白木香叶诱导的愈伤组织，用于提取总RNA及cDNA的合成。将愈伤组织进行NaCl、低温（4 ℃）、重金属（CdCl2）、干旱（甘露醇）4种胁迫和脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4种激素处理，分别于处理后的0，12，24，36，48 h取样，提取总RNA， 检测AsMYB1，AsMYB2基因在各种处理下的表达差异。

2 方法

2.1 白木香总RNA的提取和cDNA的合成

利用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（Aidla，中国）进行植物总RNA提取，利用NanoDrop 2000C 检测RNA浓度，同时利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和质量。利用Sigma公司的反转录酶MMLV 将白木香的总RNA 反转录为第一链（cDNA），反转录的条件按照说明书进行。

2.2 MYB基因序列全长克隆

根據白木香转录组高通量测序结果设计引物，引物序列见表1。以白木香总RNA的反转录产物为模板，按照下列体系对白木香中MYB基因进行扩增：cDNA 1 μL，10×LATaq buffer 5 μL，dNTP Mix （2.5 mmol·L-1 ） 4 μL，LATaq（2.5 U· μL-1） 0.5 μL，10 μmol引物各1 μL，终体积为50 μL。反应：94 ℃预变性5 min；然后进行30个循环，94 ℃ 1 min，47 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，程序循环结束后72 ℃延伸反应10 mim，4 ℃保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，切胶回收。将回收后的PCR产物与pMD19T连接，转化到DH5α菌株，在氨苄抗性的平板上进行筛选，并经过菌落PCR检测后送上海英潍捷基公司测序。

2.3 白木香MYB蛋白的生物信息学分析

通过在线软件 ProtParam 预测蛋白结构，分析目的基因编码蛋白质的氨基酸组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点及稳定性等参数；利用软件 TMHMM 2.0 进行蛋白质跨膜结构分析；将所获得的AsMYB1和AsMYB2基因编码的氨基酸序列在 GenBank 数据库中进行 Blast P 对比分析，利用 DNAMAN 对其他物种的MYB基因编码的氨基酸序列进行同源性分析；通过MEGA6.05软件构建 Neighborjoining系统进化树，进化距离的计算采用泊松校正法，Bootstrap 重复次数为1 000次。

2.4 白木香AsMYB1和AsMYB2在不同组织、胁迫及激素下的表达分析

选取长势相同的白木香愈伤组织，分别经NaCl（150 mmol·L-1）、低温（4 ℃）、CdCl2（500 μmol·L-1）、甘露醇（750 mmol·L-1）4种非生物胁迫及ABA（150 μmol·L-1），MeJA（150 μmol·L-1），GA3（150 μmol·L-1），SA（150 μmol·L-1）4种外源激素处理，在处理12，24，36，48 h提取RNA作为样品，以未处理的愈伤组织作为对照。同时提取白木香不同组织的RNA 作为样品。

利用实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR， qRTPCR）的方法检测白木香在不同处理下不同时间的表达情况。分析使用SYBR Green I荧光染料法，在qRTPCR仪上进行。选取白木香GAPDH基因作为目标基因定量表达的内参基因，引物序列见表1。反应体系：TransStart Top Green qPCR Super Mix 5 μL， 上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板0.5 μL（50 mg·L-1），补充ddH2O至10 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火/延伸30 s（每次循环后采集荧光），40个循环后，95 ℃变性10 s，65～95 ℃做溶解曲线分析，每个温度以每步0.5 ℃上升，每个温度停留5 s。实验数据通过Excel进行分析，采用2-ΔΔCt法计算获得AsMYB1，AsMYB2基因的相对表达量。

3 结果与分析endprint

3.1 白木香AsMYB1和AsMYB2基因全长cDNA的克隆

根据白木香愈伤组织转录组测序结果，以白木香愈伤组织的cDNA为模板进行扩增，利用PCR方法扩增得到2条约1 200 bp的条带，见图1。将其连接到pMD19T载体转化大肠杆菌DH5α，测序结果经过NCBI的BLAST比对，确定2个扩增产物是MYB基因的全长，2个基因分别命名为AsMYB1，AsMYB2。

MYB转录因子以其N端特有的MYB保守结构域而得名，MYB 结构域是一段约51～52个氨基酸的肽段，由一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列组成，每个MYB结构域折叠成螺旋转角螺旋M.Marker； 1.AsMYB1基因的扩增片段； 2.AsMYB2基因的扩增片段。

空间结构，其中含有3个色氨酸残基，这3个残基被18～19个氨基酸残基隔开，起着疏水核心的作用[6]。MYB 转录因子一般由3个保守的功能域组成：1个 DNA 结合结构域，1个转录激活结构域，以及1个不完全界定的负调节区[7]。根据转录因子中 MYB 结构域数量的不同，MYB家族可划分为不同的亚家族，即R1MYB（单一MYB结构域），R2R3MYB（2个重复MYB结构域），R1R2R3MYB（3个重复MYB结构域）及4RMYB（4个MYB结构域）[8]。

AsMYB1基因全长1 063 bp，编码353个氨基酸，具有1个锌指结构（1～20位氨基酸），具有1个MYB结构域（75～156位氨基酸），属于R1MYB；AsMYB2基因全长1 081 bp，编码359个氨基酸，具有2个MYB结构域R2（102～142位氨基酸）和R3（143～179位氨基酸），属于R2R3MYB。

3.2 AsMYB1，AsMYB2的生物学信息分析

3.2.1 AsMYB1，AsMYB2蛋白结构、跨膜区域分析 通过ProtParam 软件预测AsMYB1，AsMYB2基因编码的蛋白的理化性质。推测AsMYB1编码的蛋白分子式为C1690H2653N493O532S15，相对分子质量为38 870.54，理论等电点为8.17，不稳定系数Ⅱ为64.99，属于不稳定蛋白，总平均亲水性 GRAVY为-0.692，为亲水性蛋白；AsMYB2编码的蛋白分子式为C1683H2677N513O537S18，相对分子质量为39 266.96，理论等电点为9.03，不稳定系数Ⅱ为51.69，属于不稳定蛋白，总平均亲水性 GRAVY 为-0.563，为亲水性蛋白。利用TMHMM 2.0预测白木香AsMYB1，AsMYB2的跨膜区域，预测结果表明AsMYB1和AsMYB2均没有跨膜区域。

3.2.2 AsMYB1，AsMYB2分子系统进化分析 将白木香AsMYB1，AsMYB2氨基酸序列与GenBank 中其他植物中的不同MYB 氨基酸序列进行比对，通过 DNAMAN 软件与多种植物进行比对分析，见图2。比对结果表明AsMYB1氨基酸序列与木本棉Gossypium arboreu、苜蓿Medicago truncatula的同源性分别为69.30%，61.73%；而AsMYB2氨基酸序列与可可Theobroma cacao、陆地棉G. hirsutum的同源性分别为50.37%，46.93%；说明AsMYB1，AsMYB2基因在进化过程中有一定程度的保守性。

通过进化树构建软件MEGA 6.05，采用相邻连接法构建MYB进化树，进行MYB的聚类分析。通过软件构建的进化树，结果表明AsMYB1，AsMYB2蛋白氨基酸序列具有一定程度的相似性，与大豆MYB62、苜蓿MYB52等相似性相对较高，见图3。

3.3 AsMYB1和AsMYB2的组织表达特异性分析

利用实时荧光定量 PCR 检测AsMYB1，AsMYB2基因的表达特异性，研究结果表明AsMYB1基因在根中的表达量最多，其次是茎和叶。AsMYB2基因在叶中的表达量最多，其次是根和茎，见图4。说明AsMYB1，AsMYB2基因分别主要在根和叶中发挥生物学功能，推测AsMYB1和AsMYB2基因分别在白木香的根和叶起到重要作用。

3.4 AsMYB1和AsMYB2基因在非生物胁迫处理下不同时间的表达分析

以前的研究表明，MYB家族在非生物胁迫中起到重要的作用，但是关于白木香中MYB在植物防御反应中的作用目前没有研究。为研究白木香愈伤组织中基因AsMYB1，AsMYB2是否对盐、低温、重金属及干旱胁迫响应，将白木香愈伤组织分别经过NaCl、低温、CdCl2、甘露醇处理，利用实时荧光定量PCR检测AsMYB1，AsMYB2基因的表达差异。AsMYB1的表达水平在盐胁迫和低温胁迫下显著升高，分别在24，48 h达到最高；重金属胁迫（CdCl2）则使AsMYB1的表达水平在48 h内逐渐降低；在甘露醇处理下，AsMYB1的表达水平在12 h降到最低，之后逐渐升高，在36 h 内达到最高，随后降低。

AsMYB2的表达水平在盐胁迫条件下，表达水平显著上升，有趣的是，AsMYB2的表达水平在盐胁迫诱导下出现双峰现象，12 h 表达达到最高，24 h降低，而36 h又显著上升，之后降低；AsMYB2的表达水平在愈伤组织受到低温处理时显著降低；CdCl2处理则使AsMYB2 的表达水平在36 h内持续下降，随后上升；甘露醇处理使AsMYB2 的表达水平在12 h降低，但是随后迅速上升，在36 h表达水平达到最高，之后降低。这些实验结果表明属于不同MYB亚家族的AsMYB1 和AsMYB2 参与不同植物胁迫响应，在植物防御反应中起到重要的作用，见图5。

3.5 AsMYB1和AsMYB2基因在外源激素处理下不同時间的表达分析

ABA，GA3，SA，MeJA 是植物中重要的信号分子，同时在植物防御反应中起到重要作用。为研究AsMYB1，AsMYB2基因是否在植物信号传递的过程中起到重要的作用，将白木香的愈伤组织分别经过ABA，SA，GA3，MeJA 4种外源激素的诱导，采用实时荧光定量 PCR 的方法对愈伤组织中在各激素处理下不同时间基因的表达量进行分析。AsMYB1在受到外源ABA，GA3处理后表达水平显著上升，24 h 内表达水平持续升高，之后逐渐降低；在外源SA 处理下，AsMYB1的表达水平在48 h内持续升高，48 h的表达水平是0 h的8倍；另外，在外源的MeJA处理下，AsMYB1的表达水平在12 h略有上升，之后表达水平持续降低。在外源ABA 处理下，AsMYB2的表达水平在12 h显著降低，之后表达水平逐渐上升；在SA激素处理下，AsMYB2的表达水平在24 h内持续增高，24 h达到最高，之后随时间的增加而表达量下降；在外源的GA3和MeJA 的处理下，AsMYB2 的表达趋势一致，出现双峰现象，诱导后12 h基因表达量显著上升，24 h表达量下降，36 h表达量显著上升达到最高，之后随时间增加而表达量显著下降。这些实验结果表明AsMYB1，AsMYB2基因在白木香的信号传递及防御反应中起到重要的作用，见图6。endprint

4 讨论

MYB轉录因子是一类由多成员组成的超基因家族，其功能多样并且广泛参与植物的生长发育。已有的研究表明，MYB转录因子在植物应答逆境胁迫过程中扮演着非常重要的角色。在逆境胁迫下，MYB转录因子可与许多功能基因启动子区中的 MYB 结合元件结合，从而激活胁迫应答基因的表达[9]。在自然界中，只有当沉香属植物受到刺激或者损伤时，才会产生沉香[2]，说明沉香的产生机制与白木香的防御反应密切相关。本研究首次从白木香的愈伤组织中扩增得到属于不同亚家族的AsMYB1，AsMYB2基因全长，并对2个基因进行生物信息学分析。结果表明从白木香愈伤组织扩增的AsMYB1，AsMYB2基因编码蛋白质的氨基酸组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点及稳定性等很接近，两者的理化性质相似。AsMYB1，AsMYB2蛋白氨基酸序列的相似性仅为12.30%，二者相似性较低。AsMYB1氨基酸序列与木本棉G. arboreu、苜蓿M. truncatula MYB的同源性分别为69.30%，61.73%；AsMYB2氨基酸序列与可可Theobroma cacao、陆地棉G. hirsutum MYB的同源性分别为50.37%，46.93%；说明AsMYB1，AsMYB2在进化过程中有一定程度的保守性。通过聚类分析结果表明，AsMYB1，AsMYB2蛋白氨基酸序列分别与大豆MYB62、苜蓿MYB52等相似性相对较高。

已有研究表明，MYB 基因的表达具有组织特异性，在水稻和拟南芥中，大部分MYB基因主要在叶中表达[1011]，也有部分MYB基因主要在根中表达；白木香中MYB基因也具有表达特异性，AsMYB1主要在根中表达，AsMYB2则主要在叶中表达；说明AsMYB1，AsMYB2可能在不同组织重要的作用。

MYB 基因在植物非生物胁迫过程中起到重要作用；盐、低温、重金属及干旱胁迫是自然界中最常见的非生物胁迫；已有报道表明拟南芥和水稻中部分MYB基因在盐胁迫、干旱胁迫条件下能够大量表达，也有部分MYB基因在盐、干旱等条件下受到抑制，但是关于在低温和重金属胁迫下的MYB的表达水平研究较少[1012]。本研究表明，AsMYB1能够在盐胁迫和低温胁迫诱导下能够大量表达，但是重金属胁迫和干旱胁迫则使AsMYB1基因表达受到抑制；AsMYB2能在盐胁迫和干旱胁迫下表达量上升，而低温和重金属胁迫则使其表达水平受到抑制，这些实验结果说明AsMYB1，AsMYB2在植物响应胁迫中起到重要作用。MYB基因在植物信号转导中也具有重要的作用。以前的研究表明油菜Brassica napus中BnaMYB78、黄芩Scutellaria baicalensis的SbMYB2，SbMYB7、拟南芥中AtMYB15表达水平受到ABA 的调控[1315]；小麦的TaMYB4基因的表达受到外源SA，ABA，MeJA的调控[16]；拟南芥中AtMYB62能够参与GA3信号的传递[17]。因此本文中研究了AsMYB1，AsMYB2基因在外源激素ABA，SA，GA3，MeJA处理下的表达水平，实验结果表明AsMYB1基因表达量在ABA，SA，GA3诱导下显著上升，特别是外源GA3的诱导下AsMYB1基因表达量升高最多，外源MeJA对AsMYB1基因的影响不大；AsMYB2基因表达量在外源的GA3的诱导下大量表达，表达趋势出现双峰现象，同时AsMYB2基因也能够被外源的SA和 MeJA诱导，其中AsMYB2基因在外源MeJA诱导下也出现双峰趋势；而在外源的ABA刺激下AsMYB2基因的表达水平受到抑制。这些实验结果表明AsMYB1和AsMYB2基因的表达受到激素的影响，对植物体内激素信号的传导具有重要作用。因此AsMYB1和AsMYB2基因的生物信息学研究和表达分析有利于揭示白木香的防御机制，同时为白木香的结香机制研究奠定基础。

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[責任编辑 吕冬梅]endprint