巴西橡胶树CCaMK基因家族成员的鉴定和表达分析

肖小虎　隋金蕾　戚继艳　秦云霞　黄亚成　唐朝荣

摘 要 钙/钙调素依赖型蛋白激酶（CCaMK，calcium- and calmodulin-dependent protein kinase）是一种钙离子结合蛋白，在钙信号传导过程中起重要作用。本研究以已发表的CCaMK序列作为检索序列，对橡胶树和其他5种植物（木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥）的基因组和转录组数据进行全面搜索，鉴定得到6个CCaMK基因，其中包括一个橡胶树CCaMK基因，命名为HbCCaMK1。序列分析发现：5种植物的CCaMK氨基酸序列同源性较高，为73%～94%。基因结构分析发现，HbCCaMK1和所分析的其他植物CCaMK一样均，含有6个内含子、1个蛋白激酶结构域和3个EF-hand结构域；从结构和进化上看，HbCCaMK1和蓖麻、木薯2种植物的CCaMK具有较近的亲缘关系；在表达方面，HbCCaMK1在橡胶树根中表达丰度最高，其次为树叶和花；另外，HbCCaMK1的表达还与叶片发育、真菌侵染和低温胁迫有关。

关键词 巴西橡胶树 ；CCaMK ；基因家族 ；结构与进化 ；表达分析

中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.004

所有生物都依赖于复杂的信号传递网络来调控自身代谢和对环境的适应性。在众多信号传递途径中，钙离子作为细胞内第二信使发挥着重要作用[1-3]。一些钙离子感受器或钙离子结合蛋白能够识别瞬间钙离子浓度的变化，进而诱导下游蛋白质磷酸化方式和基因表達模式的改变[2]，实现植物对外界环境变化的应答。在植物中己鉴定的钙离子结合蛋白包括4种：钙调素（calmodulins，CaM）、钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPKs）、钙/钙调素依赖性蛋白激酶（CCaMKs）和钙调磷酸酯酶B类蛋白。CCaMK基因编码的蛋白包含4个结构域，分别为N-末端结构域、蛋白激酶结构域、CaM结合域和EF手性结构域。在植物中，已经从烟草、玉米、百合、百脉根、豌豆等多种植物中鉴定出CCaMK。研究发现，CCaMK广泛参与植物光信号传导、花药发育、寄主与病原的互作及逆境胁迫等多种生物学过程[4-7]。但在橡胶树和木薯等大戟科植物中却未见CCaMK相关研究的报道。本研究以已发表的CCaMK氨基酸序列为探针，对橡胶树、木薯、蓖麻、拟南芥、杨树和水稻共6种植物的基因组数据进行全面搜索，鉴定得到6个CCaMK基因家族成员，其中橡胶树、木薯、水稻等植物中仅有一个成员，而拟南芥中没有发现CCaMK成员。利用相关软件和数据库对这些家族成员的基因结构、进化和表达水平等进行了系统分析。本研究结果将有助于深入了解橡胶树CCaMK的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本实验室Solexa测序所用材料为巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）‘热研7-33-97，除了根取自组培苗（由中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃华玉伟老师赠送的‘热研 7-33-9组培苗）外，其他组织（包括胶乳、树皮、树叶、种子、雌花和雄花）均来自中国热带农业科学院试验场三队的正常割胶橡胶树（开割2年以上）；不同发育时期的橡胶树叶片取自中国热带农业科学院橡胶所种质资源圃，为1年生的‘热研7-33-97嫁接苗；乙烯利处理的材料主要来自海南省儋州市中国热带农业科学院试验场三队，品系为热研7-33-9，正常开割树（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用 1.5% 乙烯利分别在不同时间处理橡胶树，相应4个时间点为0、3、12和 24 h，具体方法参照文献[8]进行。

网上测序数据来自NCBI SRA数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），包括不同组织（PRJNA201084）、真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance，PRJNA179126）、高低温干旱胁迫（PRJNA182078）和乙烯利处理（PRJNA182079）等的数据，详细信息参见数据库中实验说明。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成员的鉴定与序列分析

为了全面鉴定橡胶树、拟南芥、杨树、水稻、木薯和蓖麻的CCaMK基因家族成员，从NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）数据库下载了6种植物的基因组和转录组数据；以已发表的CCaMK序列为探针[4-7]，对6种植物的基因组和转录组进行搜索，得到候选CCaMK基因家族成员，利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）对候选基因的结构域进行分析；再利用EMBOSS数据库的在线软件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）对基因的等电点和分子量进行批量分析。

1.2.2 基因结构与进化分析

利用在线软件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）对橡胶树和其他5种植物CCaMK基因家族成员的外显子/内含子组织结构进行分析。利用MEGA 6.0软件构建橡胶树和其他5种植物的CCaMK氨基酸序列的系统发育树，采用Neighbor-Joining方法进行分子系统学分析，进行1 000次bootstrap统计学检验。

1.2.3 基因的表达模式分析

利用本实验室和NCBI的solexa转录组数据对橡胶树CCaMK基因家族成员的表达模式进行分析[9]：将NCBI的SRA数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中与橡胶树相关的solexa转录组数据下载到本地服务器，去除低质量序列，利用程序RSEM进行表达分析[10]。

2 结果与分析

2.1 CCaMK基因的鉴定与序列分析

本研究以已发表的玉米等植物的CCaMK基因氨基酸序列为探针，利用tblastn搜索橡胶树、木薯、蓖麻、水稻、杨树和拟南芥6种植物的转录组和基因组数据，共鉴定得到了6个CCaMK基因（表1），橡胶树、木薯、水稻和蓖麻中均仅有1个，杨树中有2个，但在拟南芥中未发现同源基因，将橡胶树的CCaMK基因命名为HbCCaMK1。通过序列分析发现，橡胶树HbCCaMK1基因编码510个氨基酸，分子量为57 ku，等电点为5.6，有6个内含子。通过氨基酸多序列比对发现，橡胶树CCaMK含有多个保守的蛋白激酶和EF-hand结构域（图 1）。序列分析发现，5种植物的CCaMK氨基酸序列同源性较高，为73%～94%。

2.2 基因结构和进化分析

利用在线软件GSDS对橡胶树和其他4种植物CCaMK基因的外显子/内含子组织结构进行了分析，并结合各家族成员在进化上的相互关系进行作图（图 2）。分析发现，所分析的5种植物各家族成员，都含有6个内含子、1个蛋白激酶结构域和3个EF-hand 结构域，这和先前研究的CCaMK结构特征一致[4-7]。橡胶树、木薯和蓖麻3种植物CCaMK基因外显子/内含子的组织结构和结构域在外显子上的相对位置具有更高的相似性，在进化树上HbCCaMK1和MeCCaMK1聚在一起，说明它们具有更近的亲缘关系。另外，研究还发现，杨树的PtCCaMK2基因结构和结构域的相对位置与该物种中的另一个成员PtCCaMK1以及其他物种的CCaMK成員相比均具有较大差异，推测该基因在进化过程中发生了较大的变异。

2.3 橡胶树CCaMK基因的表达分析

利用本实验室现有的Solexa测序数据对HbCCaMK1在不同组织、不同叶片发育时期和乙烯利处理下的表达模式进行了分析。结果（图 3）表明，HbCCaMK1在根中的表达丰度最高，远高于其他组织，在花中的表达丰度也较高，而在胶乳中的表达丰度最低；随叶片的发育，HbCCaMK1的表达呈明显的上升趋势；在乙烯利处理前后，HbCCaMK1在胶乳中的表达丰度都特别低，几乎不表达。

本研究还利用NCBI的SRA数据库中的转录组数据对HbCCaMK1基因在不同实验条件下的表达情况进行了分析。结果（图4）表明，HbCCaMK1在所分析的树叶、树皮和胶乳等3种组织中表达丰度普遍较低，其中在叶片中的表达远低于树皮，这与利用本实验室的转录组数据分析的结果不太一致（图3）；乙烯利处理前后，HbCCaMK1在胶乳中的表达都很低，这与基于本实验室的转录组数据的分析结果一致；C. cassiicola侵染和低温胁迫处理可以诱导HbCCaMK1在叶片中的表达。

3 讨论

已有研究发现，CCaMK广泛参与植物的生长发育及与逆境胁迫相关的多种生物学过程[4-7]。本研究通过对6种不同植物进行全基因组搜索，共鉴定出6个CCaMK基因家族成员，其中在拟南芥中未能搜索到CCaMK。在结构域方面，CCaMK和CDPK相比主要少了第一个EF-hand结构域[11]，推测CCaMK与CDPK具有较近的亲缘关系和类似的功能，而在拟南芥中，CDPK家族基因的某些成员可能承担了与其它植物中CCaMK基因一样的功能。通过基因结构和进化方面的比较，发现HbCCaMK1与木薯、蓖麻CCaMK基因具有更近的亲缘关系，这与橡胶、木薯、蓖麻同属大戟科的结论一致。本研究充分利用现有的Solexa测序数据对HbCCaMK1的表达情况进行全面的分析。结果发现，HbCCaMK1在根中的表达丰度远远高于其他组织（图3）。有研究发现，CCaMK基因在苜蓿和百脉根中的表达丰度也最高，并且发现CCaMK基因在植物与细菌、真菌共生过程中起作用，同时与根瘤的形成有关[7，12]。据此可推测，HbCCaMK1很可能在橡胶树和根际微生物（细菌、真菌）的共生中起作用，同时在根瘤形成中发挥重要作用。在叶片发育过程中，HbCCaMK1的表达丰度呈上升趋势，说明该基因可能与橡胶树叶片的光信号应答及传导有一定的相关性。本研究还发现，HbCCaMK1的表达受真菌侵染和低温等逆境胁迫处理的诱导，表明该基因可能参与相关应答反应，在其它植物的CCaMK基因研究中也有类似的报道[4-7]。

另外，本实验室的高通量数据已被成功应用于橡胶树基因组数据的分析以及橡胶树蔗糖合成酶基因家族的相关分析，相关结果已发表在Nature Plants[13]和 Febs Journal[9]，这进一步证实了本研究结果的可靠性。综上所述，本研究首次从橡胶树中鉴定出一个CCaMK基因HbCCaMK1，并从基因结构、进化和表达等方面对其进行了初步分析，研究结果将为进一步研究HbCCaMK1在橡胶树中的功能奠定基础。

参考文献

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