三色堇DFR基因的克隆及表达分析

孙海燕++安泽伟++李琴等

摘要：从三色堇花瓣中克隆了1个花色素合成结构基因的全长cDNA，命名为VwDFR。VwDFR cDNA全长为1 340 bp，编码347个氨基酸组成的蛋白，与胡杨的DFR序列具有较高的序列一致性。VwDFR蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能结构域，属于SDR超基因蛋白家族成员。VwDFR基因在三色堇不同组织中的表达存在明显差异，在初花期的花瓣中表达量最高，且色斑区高于非色斑区。结果说明，VwDFR可能与三色堇花色形成有关。此结果为深入研究三色堇花色形成奠定了基础。

关键词：三色堇；DFR；基因克隆；表达分析；花色素合成

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0034-04

收稿日期：2015-05-19

基金项目：国家自然科学基金（编号：31060265、31260488）；海南大学中西部计划学科建设（编号：ZXBJH-XK008）。

作者简介：孙海燕（1986—），女，重庆开县人，硕士，从事园林植物资源与遗传改良。E-mail：shy0228@sina.com。

通信作者：王健，男，湖北宜昌人，博士，教授，硕士生导师，从事园林植物分子生物学。Tel：0898-66267907；E-mail：wjhnau@163.com。花形态的多样性是大自然最美丽的礼物之一，总是令生物学家着迷。生物学家对产生花卉多样性的发育遗传机制进行了深入的研究，发现金鱼草和矮牵牛是探索花对称性[1]、花色[2-4]、花瓣纹理[5]的优秀模式植物。随着研究的深入，花斑的形成逐渐被学者关注。植物花斑是指在其花瓣大小、形态和位置上基本固定的色斑[6]，主要是由于花色素在特定区域积累形成的，如三色堇黄底紫斑品种Rhinegold和白底紫斑品种Mont Blanc的花斑部分的组成色素是飞燕草素和矢车菊素[7-8]。因而，花色素在花瓣上积累的分子机理是花斑形成原因的研究重点。

花青素又称花色素，属类黄酮化合物，是一类植物次生代谢产物，广泛存在于植物细胞液泡中。自然界中主要有6类花色素，即天竺葵色素（pelargonidin）、芍药花色素（peonidin）、矢车菊素（cyanidin）、牵牛花色素（petunidin）、飞燕草色素（delphinidin）和锦葵花色素（malvidin），其生物合成和调控已有较深入的研究。花青素生物合成途径的前体物质是 4-香豆酰CoA与3-丙二酰CoA，最后形成花的颜色涉及的一系列酶有：查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI），黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）和UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）等[9-10]。

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花青素生物合成中类黄酮途径的第一个酶，负责将3种二氢黄酮醇（DHK、DHQ和DHM）还原为无色花色素苷，缺失DFR活性的突变体会产生白色。在一些植物中，DFR有严格的底物特异性，不能利用二氢堪非醇（DHK）生产天竺葵素，因而缺乏橙/砖红色。Johnson等将兰属DFR基因转入矮牵牛后，不能有效合成天竺葵素，而将非洲菊中能有效还原DHK的DFR导入到白色矮牵牛中，得到了砖红色花朵[11]。可见，围绕DFR基因进行基因操作也可以改造花色。

三色堇（Viola×wittrockiana Gams）是堇菜科堇菜属的一种多年生常作二年生栽培的草本花卉。由于其花色丰富、明艳，花期长，是花坛、花境、盆花等常用早春花卉，有“花坛皇后”之美誉，在园林绿化方面有很高的应用价值。鉴于DFR基因对植物色彩的形成非常关键，分离三色堇花瓣中DFR基因并研究其表达调控特点，将有助于阐明DFR基因在三色堇花斑形成过程中的作用。本研究拟从三色堇花瓣中克隆DFR基因的cDNA全长序列，进一步对VwDFR进行生物信息学及系统进化分析，并采用实时荧光定量PCR技术研究VwDFR在三色堇不同组织中的表达情况。

1材料与方法

1.1植物材料

本试验材料为花色黄底黑斑的三色堇（Viola × wittrockiana Gams）品种，种植于海南大学园艺园林学院基地。

1.2菌株与试剂

大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒（K1642）购自Fementas公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Sigma公司；LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体和实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ购自大连宝生物公司；引物合成和测序由上海英俊生物技术有限公司完成。其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.3方法

1.3.1总RNA的提取与cDNA第一链合成三色堇花瓣总RNA的提取采用改良Trizol法[12]，其他组织的RNA提取方法按照常规方法进行。cDNA第一链合成使用Fementas公司逆转录试剂盒，操作步骤参照产品说明书。

1.3.2三色堇ANS、DFR基因全长cDNA克隆比对 GenBank 上登录的不同物种的DFR基因，依据其保守区域序列设计特异性引物，扩增得到其保守区片段，然后根据扩增得到的序列分别设计3′-RACE和5′-RACE引物（表1）扩增3′和5′端片段，具体方法参照文献[13]。根据测序所得DFR基因的3′和5′端序列，利用DNAMAN软件进行序列拼接，获得其全长cDNA拼接序列。根据所得的全长拼接序列设计特异性引物（表1），使用Taq plus DNA polymerase进行全长cDNA扩增，引物终浓度为0.5 μmol/L，扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共32个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带，克隆至pMD8-T载体上，测序确认。

1.3.3生物信息学分析利用NCBI在线Blast工具和DNAMAN软件对全长cDNA序列进行比对分析和开放阅读框预测；利用在线软件Expasy进行氨基酸组成、稳定系数、亲水系数等分析；利用MEGA 5.10软件，以邻近法构建系统进化树。

1.3.4实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）采用罗氏公司的LightCycler 2.0系统进行荧光定量PCR，分析VwDFR基因在初花期根、茎、叶、花不同组织中的表达情况。以actin基因作为内参基因同时进行定量分析，对样品进行均一化。反应总体系为20 μL，包括2 μL模板、10 μL 2×SYBR Premix和上下游混合引物0.6 μL及ddH2O 7.4 μL；反应程序95 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共45个循环。靶基因和内参基因的引物设计见表1，数据处理采用系统自带软件。

2结果与分析

2.1VwDFR的克隆

搜索比对其他植物DFR基因序列并找出保守区域，利用PCR扩增得到这个基因片段的特异性条带，长度为241 bp（图1-A）。经分析发现它们均缺失5′和3′端，利用5′和3′RACE技术分别经过2轮扩增，得到DFR的3′末端片段约793 bp（图1-B）及5′末端序列约246 bp（图1-C）。上述片段进行Blast分析，确认与其他植物DFR同源。根据测序结果拼接后，设计引物扩增得到1 340 bp全长cDNA片段（图1-D）。

2.2序列分析

序列分析发现，三色堇VwDFR基因含有1个完整的开放阅读框，起始密码子在85位，终止密码子在1 128位。其开放阅读框为1 044 bp，编码347个氨基酸（图2）。经氨基酸序列保守结构域分析发现该基因蛋白属于SDR蛋白家族，是SDR superfamily超基因家族中的一个，该基因家族有2个高度保守功能结构域，NADP 的结合功能域和底物特异结合功能域。如图3所示，VwDFR基因在这2个功能域上是高度保守的。利用在线软件Expasy分析该基因所编码蛋白的理化性质，结果表明，VwDFR蛋白的分子量为8.61 ku，等电点为5.08，不稳定系数为40.29，平均亲水系数为0.731，属于不稳定型的疏水蛋白。此外，跨膜结构区预测结果表明，VwDFR是跨膜蛋白。

2.3系统进化分析

利用DNAman软件，根据VwDFR基因编码的氨基酸序列，在NCBI蛋白序列库中进行同源检索和比较得知，该蛋白与胡杨（Populus euphratica）、可可（Theobroma cacao）、甜橙（Citrus sinensis）、苹果（Malus domestica）等15种其他植物DFR蛋白有73%～83%的同源性，其中与胡杨DFR蛋白同源性最高，为83%。将VwDFR与这15条DFR蛋白序列进行多重比对并利用Mega 5.10构建系统进化树（图4），发现VwDFR 与杨柳科胡杨的 DFR 亲缘关系最近。从进化树还可

以看出，16条DFR蛋白序列明显地聚为2个类簇，其中 VwDFR 与甜橙、可可、胡杨等双子叶植物的DFR聚为一支，而其他单子叶植物的DFR聚为一支。总的来看，同为双子叶的三色堇DFR基因，与双子叶植物的亲缘关系更近一些，因此DFR蛋白序列的进化基本符合植物分类学的进化规律。

2.4三色堇VwDFR基因荧光定量表达分析

在三色堇开花期进行取样，从同一株植株的根、茎、叶、花中分别提取总RNA，反转录为cDNA。利用实时荧光定量PCR分析三色堇DFR基因在根、茎、叶、花中的表达情况。结果（图5）表明，VwDFR在三色堇的根、茎、叶和花中均有表达，但表达水平具有明显差异。其中，在花色素大量积累的初花期花瓣中表达量最高，在茎中的表达量最低，说明VwDFR主要在花瓣中表达，且色斑区的表达水平高于非色斑区。

3讨论与结论

本研究中利用RT-PCR同源克隆和RACE技术相结合的方法，从三色堇的花瓣中克隆得到花青素合成结构基因VwDFR全长cDNA序列。通过对其编码的氨基酸序列保守结构域分析表明，三色堇VwDFR编码蛋白N端存在2个高度保守功能结构域-NADP 的结合功能域和底物特异结合功能域，是植物SDR superfamily超基因家族蛋白的典型特征。本研究得到的VwDFR基因与其他植物DFR氨基酸序列的一致性较高，其中与杨柳科的胡杨DFR氨基酸序列一致性最高，为83%。且系统进化分析表明，VwDFR和胡杨的DFR亲缘关系较近，而与单子叶植物的鸢尾、百合和小麦等的亲缘关系较远，表明VwDFR基因的进化基本符合植物分类学的进化规律。

本研究中对三色堇不同组织器官的VwDFR荧光定量检测发现，在初花期的花瓣中表达量最高，这与李琴等的研究结果[14]一致，说明VwDFR是三色堇花色素合成的关键基因。此外，VwDFR在根中的表达量也较高，这可能与DFR基因的表达存在组织特异性有关[15]。

花色素结构基因是花色素生物合成的基础，现有的研究表明，植物花瓣上的花斑是由于花色素基因的差异性表达而形成的[16]。DFR基因首次从玉米（Zea mays）和金鱼草（Antirrhinum majus）中分离得到，后来相继从其他多种植物（如拟南芥、三叶草、玫瑰、兰花、非洲菊等）中克隆出DFR[17-19]。研究发现一些植物花瓣上花斑的形成与DFR基因的差异性表达相关，如蝴蝶兰小丑型品种中其花瓣上大块的紫色色斑，主要由于是DFR基因在色斑区特异性表达导致[20]；在文心兰的花瓣和萼片中，其色斑形成的基础是因为OgCHI 和OgDFR基因表达被遏制[21]；而在百合品种Sorbonne中，LhDFR在无色斑的边缘区域表达水平很低，但在花被片的色点部位以及有色斑的中心部位高度表达[22]。

综上所述，笔者初步推测本试验所克隆得到的VwDFR基因可能在三色堇花瓣中存在差异性表达，三色堇花瓣花色及色斑的形成可能与VwDFR的表达有关。本研究结果为深入揭示三色堇花色及色斑形成奠定了基础，进而为创新花色奠定基础。

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