香蕉NPR1E基因的克隆及表达分析

王卓等

摘 要 NPR1基因可参与调节植物对病原菌的广谱抗性，在植物系统抗性中起着关键的调控作用。通过RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法从香蕉根系中获得NPR1E基因，命名为MaNPR1E（GenBank登录号分别为：KF582550）。MaNPR1E是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA，包含一个1 755 bp的最大开放阅读框，编码一个含584个氨基酸的蛋白质。经蛋白质序列同源比对发现，其含有完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域，属于典型的NPR1蛋白。系统进化树比对分析表明，MaNPR1E与海枣PdNPR3（XP_008808341.1）和油棕EgNPR3（XP_010914123.1）的亲缘关系较近。组织特异性研究表明，该基因组成型表达于香蕉各组织。实时荧光定量PCR分析表明，接种枯萎病菌后MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制，而在抗病品种中被激活；MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导。上述结果表明，MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病过程中扮演重要的调控角色。

关键词 香蕉 ；MaNPR1E ；基因克隆 ；表达分析

分类号 S668.1

Molecular Cloning and Expression of MaNPR1E Gene from Banana

（Musa acuminata L. AAA group， cv. Cavendish）

WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）

LIU Juhua1） ZHANG Jianbin1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）

（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101；

2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102）

Abstract NPR1（nonexpressor of PR gene 1），involved in regulating plant broad-spectrum resistance，plays important roles in plant system resistance. In this study， we report the molecular characteristics of NPR1E gene cloned from banana（Musa acuminate L. AAA group， cv. Cavendish）using a RACE-PCR-based strategy. MaNPR1E（accession number：KF582550） contained an open reading frame of 1 755 bp which encoded a polypeptide of 584 amino acids. Protein alignment showed that they contain the complete typical conserved BTB/POZ （BR-C， ttk and bab/Pox virus and Zinc finger）domain， ankyrin repeats and NPR1/NIM1 like defence protein C terminal，which belongs to a typical NPR1 protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaNPR1E also have high similarity to PdNPR3（XP_008808341.1） and EgNPR3（XP_010914123.1） from Phoenix dactylifera and Elaeis guineensis，respectively. Tissue-specific studies showed that the expression of MaNPR1E was constitutive expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaNPR1E was decreased. While in resistant varieties the time point of MaNPR1E， compared to control， increased higher than that in susceptible varieties at time points， also the expression of MaNPR1E was induced by Ethephon and salicylic acid. These results suggest that MaNPR1E may play an important role in the regulation of Banana resistance to the infection of Foc TR4.

Keywords banana ； MaNPR1E ； gene clone ； expression analysis

病原菌与植物在协同进化中，植物形成一系列复杂的防御机制来避免病原菌的侵害，如系统获得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）和诱导系统抗性（inducted systemic resistance， ISR）。SAR是植物在遭受病原菌侵染后产生的防御反应，通过激活PR基因的表达来抵抗病毒、细菌和真菌的侵染[1]，水杨酸是植物建立SAR所必须的物质[2]。ISR的建立依赖于茉莉酸（jasmonic acid， JA）和乙烯（ethylene， ET）的介导[3-4]。NPR1（nonexpressor ofpathogenesis related genes 1）参与植物SAR和ISR的建立[1-2，5]。NPR1 基因编码的蛋白通常在N-末端包含一个BTB/POZ（broad-complex， tramtrack， and bric-a-brac/poxvirus and zinc finger）结构域和一个锚蛋白重复结构域ANK （ankyinrepeat domain）， 这2 个结构域在与其它蛋白质互作时起着重要作用[6-7]。NPR1参与的生理过程为：在正常生长状态下，NPR1蛋白通过二硫键形成寡聚体存在于细胞质中。当植物感染病原菌后， SA 的积累改变了细胞中的氧化还原势， NPR1寡聚体解体后形成单体，进入细胞核内并与TGA-bZIP转录因子互作，进而调控一些启动子中含有as-1/ocs 顺式作用元件的PR 基因的表达[2，8-9]。至今，已从多种植物中克隆了NPR1 基因及其同源基因，并对部分基因的功能进行了不同程度的研究[6，10]。到目前为止，已经克隆到香蕉NPR1基因中的4个成员，包括MNPR1A、MNPR1B[11]，MdNPR1[12]，MuNPR1-1[13]。在香蕉A基因组中预测出了8个NPR1基因[14]，表明香蕉NPR1基因的克隆及功能分析还需进一步完善。

香蕉是热带、亚热带发展中国家重要的农作物之一，其果实富含蛋白质和碳水化合物，是一些热带地区人们食用的主要水果种类和国民收入的主要来源[15]。然而香蕉枯萎病严重威胁香蕉的正常生产[16]。NPR1在植物抗病中起着重要作用，是调控植物抗病反应的一个关键基因[2，11-12]，因此了解香蕉NPR1基因的功能将有助于揭示NPR1介导的抗病途径与香蕉枯萎病的密切关系。在此之前，笔者利用RNA-seq方法获得香蕉根系转录组[17]，基于转录组信息从香蕉根系中克隆了一个MaNPR1E基因，利用生物信息学网站分析该基因的结构特性，采用荧光定量技术分析该基因的表达模式，探讨枯萎病菌胁迫下MaNPR1在香蕉根系中的表达调控，有助于进一步了解香蕉抗枯萎病的调控机理。

1 材料与方法

1.1 材料

供试香蕉品种为‘巴西蕉（cv. Cavendish AAA）和‘农科1号（cv. Nongke No. 1）（购自中国热带农业科学院组培中心），为移栽大棚后约60 d的健康杯苗，其中‘巴西蕉为病菌的感病品种，‘农科1号为病菌的耐病品种。香蕉枯萎病菌4号生理小种（FusariumOxysporum f specialis （f. Sp） cubense Tropical Race 4， Foc TR4），由中国热带农业科院环植所张欣博士馈赠。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的培养和收集

将于-80℃中以25%甘油保存的香蕉枯萎病4号生理小种孢子悬浮液接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，于28℃培养7 d，用无菌水将孢子洗下来，用2层Mirocloth膜过滤，滤液以4 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀用50 mL无菌水重悬，再以4 000 r/min离心15 min，孢子用无菌水洗2次，然后调到合适的浓度。

1.2.2 香蕉接种Foc TR4及激素处理

将‘巴西蕉和‘农科1号分为2组，每组60颗幼苗。以蘸根接菌法接种Foc TR4，接种浓度为1×106个/mL，分别于接种后2、4、6 d取样，以未接种的为对照（0 d）；分别以100 μmol/L 脱落酸（abscisic acid，ABA）、1%（V/V） 乙烯利（ethephon， ETH）、100 μmol/L 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）和100 μmol/L 水杨酸（salicylic acid， SA）处理‘巴西蕉幼苗，以去离子水处理为对照。上述每个处理重复3次。于液氮中速冻后， 置于-80℃冰箱备用。

1.2.3 MaNPR1E的克隆及分析

在香蕉根系转录组测序结果的基础上，设计5'RACE引物，按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）说明书进行RACE反应；扩增获得的DNA序列经过测序后在NCBI核酸数据库BLASTn和蛋白数据库BLASTx中进行同源核苷酸和蛋白序列检索；应用DNAMAN、ProtParam和MEGA4等生物软件分析获得cDNA序列及其编码蛋白质的结构特点，并将其与NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）、香蕉A基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中已知的核酸和蛋白序列进行比较分析。

1.2.4 MaNPR1E在香蕉不同器官中的表达分析

选取生长8个月的香蕉根、球茎、假茎、叶、花和果实，按照Wan等[18]的方法提取RNA；每个样品取4 μg总RNA，用Invitrogen SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase合成cDNA第一链；以香蕉根、球茎、假茎、叶、花和果实的cDNA为模板，以MaActin片段为内参，采用RT-PCR方法对其进行组织特异性表达分析；将MaNPR1E在香蕉A基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中进行比对，以确定该基因是否属于香蕉A基因组。在序列5′端非保守区域设计MaNPR1E基因表达引物，引物序列为P1（5′-GTTCGCCTTGTTCGGTTG-3′）和P2（5′-ACTTCGGATTGGATGGAC-3′）。MaActin1引物为P1（5′-CGAGGCTCAATCAAA-GA-3′）和P2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）。

1.2.5 MaNPR1E基因的表达检测

采用实时定量PCR检测MaNPR1E基因的表达，试剂盒购自TaRaKa公司，染料为SYBR Green，在Mx 3005P荧光定量PCR仪（吉泰生物科技公司）上进行。分别以接种Foc TR4后不同时间点的经ABA、乙烯利、茉莉酸甲酯和水杨酸处理过的巴西蕉根系cDNA第一链为模板，以MaActin片段为内标，引物同“1.2.4”。荧光定量PCR的反应程序如下：95℃预变性3 min；95 ℃变性7 S，60℃退火15 S，72℃延伸20 s，共40个循环。

1.3 数据统计分析

每个实验组均做3 次生物学重复，利用SAS软件（SAS 9.0 for Windows）进行显著性分析，“*”、“**”分别表示差异达到显著（p<0.05）和极显著（p<0.01）水平。结果用KyPlot软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 MaNPR1E克隆与序列分析

在香蕉根系转录组测序[17]的基础上，成功克隆一个香蕉NPR1基因ORF，测序后经BLAST比对发现，该序列与其他植物NPR1基因序列具有较高的同源性，表明该序列是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA，命名为MaNPR1E，GenBank登录号为：KF582550。MaNPR1E序列全长为2 082 bp，其中5′非翻译区123 bp，3′非翻译区204 bp，含有一个1 755 bp的ORF，编码584个氨基酸残基（图1），可编码预期分子量为64.88 ku和等电点为6.66的氨基酸序列。将MaNPR1E推导的氨基酸序列与香蕉A基因组[14]进行比对，找到与其高度同源的蛋白序列GSMUA_Achr5P02120，进一步分析表明，两者在氨基酸水平有4个位点存在差异，分别是第261、295、430、524号位点，相似度为99.32%。利用DNAMAN软件将MaNPR1E与之前报道的4个NPR1（MNPR1A、MNPR1B[11]，MdNPR1[12]，MuNPR1-1[13]）进行比较发现，其相似度仅为53.48%（结果未显示）。在GenBank中对MaNPR1E蛋白质进行保守结构域搜索和同源性分析，结果表明，MaNPR1E蛋白属于NPR1家族成员，其氨基酸序列包含1个BTB/POZ结构域（73～198，图2 红线区域）、1个锚蛋白重复ANK序列（279～374，图2蓝线区域）和1个NPR1-like-C结构域（379～566，图2 绿线区域）。利用软件MEGA4.0中的NJ法构建MaNPR1E基因的氨基酸序列和其他植物的NPR类基因氨基酸序列的系统进化树，结果发现，以MaNPR1E与海枣 （Phoenix dactylifera， XP_008806697.1）和油棕（Elaeis guineensis， XP_010908601.1）的NPR3蛋白同源关系最近（图3）。

2.2 MaNPR1E组织特异性表达分析

采用荧光定量RT-PCR方法，以MaActin作为内参，分别检测香蕉不同部位MaNPR1E mRNA转录水平的变化。结果表明，MaNPR1E在所有组织中均有表达；在假茎中表达量最高，是根中的1.8倍，在花中表达最低，约为根的一半（图4）。

2.3 不同抗性的香蕉品种接种Foc TR4后MaNPR1E的表达分析

在感病品种中，MaNPR1E的相对表达量在接种FocTR4后逐渐下降，且差异达到极显著水平。在接种后6 d时达到最低，仅为对照的1/3（图5）。在耐病品种中MaNPR1E的相对表达量在接种Foc TR4后显著增加，在接种后4 d时达到最大，是对照的4.1倍。因此从相对表达量的变化上看，MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制，而在抗病品种中被激活，表明该基因参与香蕉抗枯萎病的过程。

2.4 MaNPR1E对激素处理的响应

为了检测MaNPR1E对不同激素处理的响应情况，分别用脱落酸（ABA）、乙烯利（ethephon）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）对巴西蕉根系进行处理。MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导，均在处理12 h达到最大值，其相对表达量分别为对照的3.97倍和2.07倍；MaNPR1E的表达在MeJA处理6、12 h时均被抑制，在24 h时恢复到对照水平；MaNPR1E的表达在ABA处理下显著被抑制，在处理24 h时约为对照的1/3（图6）。这些结果表明，MaNPR1E可能参与乙烯利和水杨酸介导的抗病信号途径。

3 讨论

NPR1是调控植物抗病的关键调节因子，通过调控病程相关基因的表达来提高植物对病原菌的抗病性。本研究获得一个全长香蕉NPR1E基因（图1）。在序列分析方面，该基因与其他植物的NPR1基因具有较高的同源性。MaNPR1E编码的氨基酸分子量为64.88 ku，等电点为6.66，这与已报道的其它植物NPR1蛋白特征相似[6，8-9，11-13，19]。MaNPR1E推导的氨基酸序列中包含完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域（图2），这些NPR1基因典型的特点表明MaNPR1E属于植物NPR1基因[11-13]。将MaNPR1E在香蕉A基因组[14]数据库中进行BLAST比对，结果发现一个与其高度同源的NPR1基因（表1），表明栽培的巴西蕉品种（AAA group）与测序的DH-Pahang品种（AA group）亲缘关系很近，同时也表明，2个品种的NPR1基因是同源基因[14]，其差异主要是序列间的SNP形成的（结果未列出），这些SNP可以作为潜在的分子标记为后续的香蕉育种服务。聚类分析结果表明，MaNPR1E与海枣和油棕的NPR3亲缘关系较近（图3）。上述结果均表明，MaNPR1E基因编码的蛋白确实为一个新的香蕉NPR1蛋白。

己有研究表明，NPR1基因在植物组织中呈组成型表达[20]，在本研究中，供试的根、球茎、假茎、叶、花和果实中也均检测到MaNPR1E的表达（图4），表明MaNPR1E在香蕉组织中属于组成型表达，根据这一结果推测，该基因可能在香蕉的生长和发育过程中起着重要作用。在拟南芥中，NPR1基因是调控植物抗病性的关键基因之一[2，6]，它不仅直接参与植物的系统获得性抗性调控和其他类型的诱导抗病性，还在植物基因介导的抗病反应和植物基础防卫反应中起着核心调控作用[1-2]。过表达AtNPR1基因能增强拟南芥对丁香假单胞菌和霜霉菌的抗性[6]；在缺失NPR1基因后，拟南芥植株易感这些病原菌[21]。在接种Foc后，MNPR1A在耐病品种的表达量高于感病品种[11]；接种FOC R4后，MdNPR1在抗病品种“Dongguan Dajiao”中的表达量高于感病品种“Fenjiao”[12]。在本研究中，接种Foc TR4后，MaNPR1E同样在抗病品种中上调表达而在感病品种中下调表达（图5），说明其可能参与了香蕉抗枯萎病的防卫反应。已报道的MaNPR1A、MaNPR1B和MdNPR-1基因均受外源水杨酸的诱导[11，13]，同样MaNPR1-A和MNPR1B不受外源MeJA的诱导[11]，这与本研究结果相吻合。值得一提的是，在ISR建立的过程中茉莉酸和乙烯起着重要作用[12]。本研究结果表明，MaNPR1E基因明显受外源乙烯利的诱导（图6），表明香蕉MaNPR1E基因可能在乙烯介导的ISR中也起一定的作用。由此可见，该基因是否参与依赖于茉莉酸和乙烯介导的诱导系统抗性及如何提高香蕉的抗枯萎病能力值得深入研究。

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