高效液相色谱法和气相色谱法分析肟菌酯原药的方法比较

陈颖 刘小锋 陈一萍 廖丽萍 傅洪涛

摘要：建立高效液相色谱法和气相色谱法，来测定肟菌酯原药有效成分的定量分析方法比较。用Agilent C18柱，采用甲醇和水为流动相，通过二极管阵列检测器波长为250 nm；AE.SE-30毛细管柱，以邻苯二甲酸二环己酯为内标物，FID检测器分别对肟菌酯有效成分进行定量分析。高效液相色谱法和气相色谱法的线性相关系数分别为0.999 9、0.999 5，标准偏差分别为0.21、0.19，变异系数分别为0.21%、0.19%，平均回收率分别为99.74%和99.67%。通过比较，两种方法都能很好地用于肟菌酯原药的定量分析。

关键词：高效液相色谱；气相色谱；肟菌酯

中图分类号：TQ450.7 文献标志码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20240117

基金项目：湖南省科技创新计划重点项目（2022NK2053）。

Comparison of methods for original drug of trifloxystrobin by HPLC and GC

Chen Ying， Liu Xiaofeng， Chen Yiping， Liao Liping， Fu Hongtao

（ 1. National Engineering Research Center for Agriculturals， Hunan Research Institute of Chemical Industry Co.， Changsha， Hunan 410014； 2. Supervision and Inspection Authorization Station of Chemical fertilizer and Pesticide Quality in Hunan， Changsha， Hunan 410014 ）

Abstract： Comparison of methods for quantitative analysis of the active ingredients of trifloxystrobin was determined by HPLC and gas chromatography. By a diode array detector wavelength at 250nm and FID detector， the active ingredient of trifloxystrobin was analyzed quantitatively With a Agilent C18 column and a AE.SE-30 Capillary column， using methanol and water as the mobile phase and dicyclohexyl phthalat as the internal standard. The results showed that the linear correlation coefficients of HPLC and gas chromatography were 0.999 9 and 0.999 5， the standard deviations were 0.21 and 0.19， the coefficient of variation was 0.21% and 0.19%， and the average recovery was 99.74% and 99.67% respectively. By comparison， the both methods are good for quantitative analysis of trifloxystrobin.

Key words： HPLC； GC； trifloxystrobin

肟菌酯是由德国拜耳公司开发的新型含氟杀菌剂，是具有杀菌活性的天然抗生素strobilurin A的合成类似物，对半知菌类、子囊菌类、卵菌纲和担子菌类等具有良好的杀菌活性[1]。肟菌酯[2]杀菌谱广、活性高、对作物具有治疗和保护作用，可有效防治锈病、白粉病、霜霉病、网斑病、稻瘟病等[3-4]。肟菌酯虽然可以有效防治真菌病害，但是不合理地使用引发的残留会对水生生态系统与土壤产生破坏。研究表明，肟菌酯可诱导蚯蚓产生氧化应激及造成DNA损伤[5]，对蜂类具有较高的毒性风险[6]，且容易通过雨水作用进入水体中累积。肟菌酯代谢产物肟菌酸比母体的毒性更强，更容易通过雨水淋滤造成水体和土壤污染。为了保护人类及动物的安全，全球很多国家建立了肟菌酯在水果、蔬菜中的最大残留量（MRL）。为了防止肟菌酯残留造成的影响，必须严格遵守农药制剂的使用范围和使用方法，避免超过量使用。而控制农药制剂最有效的方法就是对农药有效成分的含量检测。肟菌酯定量检测方法有很多种， 万宏剑等[7]采用高效液相色谱，用甲醇—乙腈—水的三元体系来分离测定肟菌酯原药，线性相关系数为0.999 9，变异系数分别为0.26%，平均回收率为100.3%。江小雪[8]通过气相色谱仪，用DB-1毛细管柱对肟菌酯原药进行分离和测定，线性相关系数为0.999 9，变异系数分别为0.13%，平均回收率为99.68%。但是气相色谱法和液相色谱法的综合方法比较目前暂没有报道。本研究拟利用高效液相色谱仪[9]和气相色谱仪[10]分别对肟菌酯原药的有效成分进行分离和定量分析，以期为农药分析工作者提供更多简便可行的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20AT液相色谱仪（SPD-M20A光电二极管阵列紫外-可见光检测器，SIL-20A自动进样器，N2000 工作站）：日本岛津公司；GC-2010plus气相色谱仪（AOC-20S自动进样器，带氢火焰离子化检测器（FID），GC-2010plus-System Administrator工作站）：日本岛津公司；AUY2200电子天平：日本岛津公司；AS3120超声波清洗仪：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；10 μL微量进样器：日本岛津公司；0.45 μm滤膜：上海安谱实验科技股份有限公司；肟菌酯标样（质量分数99.0%）：沈阳化工研究院有限公司；邻苯二甲酸二环己酯（不含有干扰杂质）：沈阳化工研究院有限公司；肟菌酯原药：湖南万家丰有限公司；甲醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；丙酮（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；水（色谱纯）。

1.2 液相色谱法

1.2.1 高效液相色谱操作条件

保护柱：4.0 mm×10 mm不锈钢柱，内填C18的填充物，粒径5 μm；Agilent C18色谱柱：250 mm×4.6 mm不锈钢柱，内填C18的填充物，粒径5 μm；流动相：甲醇—水（V甲醇∶V水=78∶22）；流速： 1.2 mL/min；柱温箱温度： 30 ℃；检测波长： 250 nm；进样体积： 20 μL。

1.2.2 标准物质的配制

称取标准物质0.05 g（精确至0.000 1 g）于25 mL的容量瓶中，加甲醇20 mL置于超声波溶解超声10 min，冷却到室温后用甲醇稀释至刻度线，混匀。然后用移液管移取上述标准溶液1 mL于25 mL的容量瓶中，用流动相定容。

1.2.3 试样的配制

称取试样物质0.05 g（精确至0.000 1 g）于25 mL的容量瓶中，加甲醇20 mL置于超声波溶解超声10 min，冷却到室温后用甲醇稀释至刻度线，混匀。然后用移液管移取上述试样溶液1 mL于25 mL的容量瓶中，用流动相定容。

1.2.4 测定方法

在1.2.1仪器设定的条件下，待液相色谱仪基线稳定后，连续进多针标样溶液，待相邻两针肟菌酯保留时间与峰面积相对值变化都小于1.0%。然后按照标准、试样、试样、标准溶液进行测定。肟菌酯液相色谱图中的保留时间约为9.1 min，肟菌酯标样高效液相色谱图如图1所示。

式中：W2为试样肟菌酯原药的质量分数，%；M1为肟菌酯标准物质的质量，g；A1为标样溶液中肟菌酯峰面积的平均值；A2为试样溶液中肟菌酯峰面积的平均值；M2为试样的质量，g；W1为标样中肟菌酯的质量分数，%。

1.3 气相色谱法

1.3.1 气相色谱操作条件

色谱柱：AE.SE-30 30 m×0.53 mm（id）大口径毛细管柱（100%甲基聚硅氧烷键合型，膜厚1.0 μm）；气化室温度：250 ℃；色谱柱温度：230 ℃；检测器温度：250 ℃；总载气流量（高纯氮气）：318.4 mL/min；气谱柱流量（高纯氮气）：16.95 mL/min；吹扫流量（高纯氮气）：3.0 mL/min；尾吹流量（高纯氮气）：30.0 mL/min；氢气流量：40.0 mL/min；空气流量：400.0 mL/min；分流比：17∶1；进样体积：1 μL。

1.3.2 内标溶液的配制

称取约0.7 g（精确至0.000 1 g）内标物邻苯二甲酸二环己酯于100 mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度线，摇匀备用。

1.3.3 标准溶液的配制

称取肟菌酯标准物质0.05 g（精确至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用移液管移取1.3.2的内标溶液5 mL于10 mL容量瓶中，摇匀备用。

1.3.4 试样溶液的配制

称取肟菌酯原药0.05 g（精确至0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用移液管移取1.3.2的内标溶液5 mL于10 mL容量瓶中，摇匀备用。

1.3.5 测定方法

在1.3.1仪器设定的条件下，待气相色谱仪基线稳定后，连续进多针标样溶液，待相邻2针肟菌酯与内标物保留时间比和峰面积比的相对值变化都小于1.0%。然后按照标准、试样、试样、标准溶液进行测定。肟菌酯保留时间约为3.5 min，内标物保留时间约为5.4 min。肟菌酯标样的气相色谱图如图2所示。

式中：X为试样肟菌酯原药的质量分数，%；M1为肟菌酯标准物质的质量，g；M2为肟菌酯原药的质量，g；S1为标准溶液中肟菌酯的峰面积与内标物峰面积比的平均值；S2为试样溶液中肟菌酯的峰面积与内标物峰面积比的平均值；P为肟菌酯标准物质的纯度，%。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法波长的选择

对肟菌酯进行紫外-可见光谱扫描，得到肟菌酯的紫外-可见吸收波长（图3）。根据基线的噪音和肟菌酯的紫外-可见吸收响应值的大小，在250 nm下有较好的吸收，并且杂质峰也能很好的分开。肟菌酯试样的高效液相色谱图如图4所示。

2.2 高效液相色谱法条件的流动相的选择

本文通过乙腈和水、甲醇和水分别做流动相来测定肟菌酯，甲醇水体系和乙腈水体系分离效果都很好。但是乙腈的价格比甲醇的价格贵很多，且乙腈的毒性比甲醇的毒性大，因此选取毒性小、价格便宜的甲醇做为流动相。通过甲醇和水不同的比例来选取最佳的流动相比例，最终确定甲醇—水（V甲醇∶V水=78∶22）为肟菌酯原药的最佳的流动相比例。该比例能够很好地分离杂质，且目标峰峰型对称，呈现正态分布。

2.3 内标物的选择

为了使内标物与肟菌酯以及其杂质能够很好地分离，并且内标物质的保留时间和响应值与肟菌酯的保留时间和响应值相差不大。实验中选取了邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二正戊酯、邻苯二甲酸二甲酯、正十五烷等常用的内标，结果显示在上述气相色谱条件下，用邻苯二甲酸二环己酯作内标物时，肟菌酯色谱峰与内标物色谱峰能很好的分离，出峰时间适中，没有杂质重叠的干扰，峰形左右对称。肟菌酯试样的气相色谱图如图5所示。

2.4 方法的线性相关测定

准确称取含有肟菌酯0.051 9 g的标样于25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL置于超声波溶解超声10 min，冷却到室温后用甲醇稀释至刻度线，混匀。用移液管分别移取0.25、0.50、1.0、2.0、3.0 mL上述肟菌酯标样溶液至5个25mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度线，摇匀备用。配制成质量浓度为20.55～246.63 μg/mL的标准溶液，在1.2.1仪器设定的条件下测定。以肟菌酯质量浓度为横坐标，对应的吸收峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程y=42 583x+40 424，相关系数为R2=0.999 9，说明肟菌酯在20.55～246.63 μg/mL的质量浓度范围内具有很好的线性关系。称取5组不同质量的肟菌酯标样于10 mL容量瓶中，按照1.3.2中的同一移液管精确移取5 mL内标溶液，然后再用丙酮定容，摇匀，分别配制0.506、1.265、2.530、5.060、12.650 mg/mL的标准溶液，按1.3.1气相色谱条件进行测定。以肟菌酯质量浓度为横坐标，对应的肟菌酯峰面积与内标物的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程y=0.347 3x-0.051 8，相关系数为R2=0.999 5，说明肟菌酯在0.506～12.650 mg/mL的质量浓度范围内具有很好的线性关系。两种方法都呈现很好的线性关系，可以完全满足肟菌酯的定量分析。

2.5 方法的精密度测定

对同一样品平行测定6次，在上述1.2.4、1.3.5的步骤下，测定肟菌酯原药的质量分数，结果见表1。采用高效液相色谱法其标准偏差为0.21，变异系数为0.21；采用气相色谱法其标准偏差为0.19，变异系数为0.19。说明两种检测方法精密度良好，可以满足肟菌酯日常的检测需要。

2.6 方法的准确度测定

平行称取一定量的肟菌酯试样，分别加入6个不同质量的肟菌酯标准样品中，经溶解后定容，按照1.2.4、1.3.5的步骤下测定其回收率，结果如表2、表3所示。采用高效液相色谱法回收率为99.03%～100.39%，平均回收率为99.74%，准确度好；采用气相色谱法回收率为99.00%～100.58%，平均回收率为99.67%，准确度好。

3 结 论

实验结果表明，采用高效液相色谱和气相色谱两种方法对肟菌酯原药进行定量分析，线性关系好，精密度和准确度高，均能得到很好的结果。分析人员可以根据自身的情况，选取合适的方法分析。本研究更推荐使用高效液相色谱仪，外标法操作相对简单，处理也更容易，尤其适用于初学的分析工作者。

参 考 文 献

[1] 郭建法，王涛.杀菌剂肟菌酯的合成工艺优化[J].世界农药，2022，44（11）：36-40.

[2] 肟菌酯[J].农药科学与管理，2010，31（4）：57-58.

[3] 夏海波，王守明，潘好芹. 42.8%氟菌·肟菌酯悬浮剂对番茄叶霉病的田间防效[J].农药，2014，53（7）：518-519.

[4] 焉山.75%肟菌酯·戊唑醇水分散粒剂防治水稻纹枯病药效试验[J].现代化农业，2021（12）：8-9.

[5] WU R L， ZHOU T T， WANG J， et al. Oxidative stress and DNA damage induced by trifloxystrobin on earthworms（Eisenia fetida） in two soils[J]. Science of The Total Environment，2021，797：149004

[6] 欧阳小庆，吴迟，王长宾等.肟菌酯对环境生物急性毒性及安全性评价[J].生态毒理学报，2017，12（4）：327-336.

[7] 万宏剑，叶淑芳，谭波.肟菌酯原药高效液相色谱分析[J].农药，2011，50（11）：820-821.

[8] 江小雪.肟菌酯气相色谱分析方法研究[J].农药科学与管理，2011，32（9）：43-45.

[9] 赵梦芸，陈艳，袁婷婷，等.高效液相色谱技术在食品检测中的应用探讨[J].粮食科技与经济，2020，45（5）：76-77.

[10] 张舸，张宏，李德国，等.气相色谱法检测粮食中6种有机磷农药残留量[J].粮食科技与经济，2022，47（2）：76-79.