高效液相色谱—串联质谱法测定槟榔中9种有机磷农药残留

龚敏　梁振纲　孙慧洁

摘 要 建立槟榔中9种有机磷农药残留的三重四级杆液相色谱-质谱联用分析方法，采用1%乙酸-乙腈溶液作为提取液，直接稀释后以液相色谱-串联质谱仪在多反应监测模式（MRM）下检测。研究结果发现，9种有机磷农药成分的线性范围均在2～20 ng/mL，相关系数r均大于0.999。方法的平均回收率在73.4%～120%，RSD为0.59%～9.93%，方法检出限为50.0 μg/kg。此方法具有良好的回收率及稳定性，可用于槟榔中有机磷农药残留的测定。

关键词 槟榔 ；有机磷农药 ；高效液相色谱-串联质谱

中图分类号 TS255.7 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.017

Abstract To establish a new method for analysis of residues of nine organophosphorus pesticides in Areca catechu Linn by using HPLC-MS-MS， one percent of acetic acid in acetonitrile was used as an extraction solvent for determination of organophosphorus pesticides by using HPLC-MS-MS. The results showed that the linear range of components of nine organophosphorus pesticides was 2～20 ng/mL with the correlation coefficient r being above 0.999. The average recovery was 73.4%～120%， and the RSD was 0.59%～9.93%. The limit of detection （LOD） was 50.0 μg/kg. This method had good stability and high recovery rate， and can be used to detect organophosphorus pesticide residues in Areca catechu Linn.

Keywords Areca catechu Linn ； organophosphorus pesticide ； HPLC-MS-MS

槟榔（Areca catechu Linn）是棕榈科植物槟榔的种子，位列中国四大南药之首[1]。味苦、性辛、温，归胃、大肠经，有杀虫、破积、下气、行水的功效[2]。具有驱虫[3-4]、镇痛、消炎、抗氧化[5]、抗病原微生物、拟胆碱[6]等药理作用。海南是中国槟榔的主要产区，主要是以鲜果或干果供应槟榔加工企业生产槟榔嚼块。然而2013年“槟榔致癌”风波爆发以来，海南省槟榔产业受到严重影响。“槟榔致癌”风波使人们更加关注槟榔的质量安全、控制和检测。

有机磷农药残留是影响食用槟榔产品质量的重要因素之一，是槟榔产业链在种植、加工、保存环节中主要外源性有害物质之一[7-8]。目前有机磷农药常用的检测方式主要有气相色谱法（GC）、气质联用法（GC-MS）和液质联用法（LC-MS/MS）。有机磷农药易气化，且气相色谱稳定性较好，被广泛地用于有机磷农残的定量检测中[9]。为减少干扰物质的影响，通常将气相色谱和质谱仪联用，可以更加准确的定量和定性[10-11]。目前有机磷农药的定性定量检测大部分采用的是气相色谱或气质联用方法。但气相色谱的缺点是分离时间长，检测效率不高。而高效液相色谱可以对非挥发性和热不稳定性物质进行检测，与质谱联用后可以提高灵敏度，与二级质谱的联用还可对准分子离子进行裂解，获得丰富的结构信息，具有高效率和良好的定性、定量能力[12]。随着多残留检测技术的发展，液质联用技术越来越多地被应用于农药残留检测领域[13-14]。本文针对槟榔中常见的9种有机磷农药，采用高效液相色谱-串联质谱联用技术，优化色谱质谱条件，建立了槟榔中9种有机磷农药的定性、定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

美国安捷伦公司Agilent 1200 超高效液相色谱仪、美国ABI 公司API 4000Q 四极杆质谱仪、美国Varian公司Harvard Ⅱ针泵、广州IKA公司MS3涡旋混匀器、5810R离心机、G-285 电子天平。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、乙酸、乙酸铵（色谱纯级）、甲胺磷、敌百虫、伏杀硫磷、甲基嘧啶磷、速灭磷、杀扑磷、亚胺硫磷、治螟磷、三唑磷。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配置

有机磷农药类标准品均购自国家标物中心，浓度为100 μg/mL。分别准确吸取各标液0.1 mL加入100 mL容量瓶，乙酸乙酯定容，得到浓度为0.1 μg/mL的9种有机磷农药混合标准溶液。

1.2.2 样品前处理

槟榔干果，经粉碎机粉碎，剪碎其纤维，准确称取1.00 g（精确至0.01 g）至50 mL具塞离心管中，加入20 mL 1%乙酸-乙腈，涡旋震荡5 min，加入2 g无水硫酸钠，涡旋混合1 min，9 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液待测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Thermo Accucore aQ 2.1×100 mm，2.6 μm，填料为C18；柱温：40℃；流速：0.4 mL/min；进样量：10 μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱，洗脱条件见表1。

1.2.4 质谱条件优化

离子源：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；多反应检测模式（MRM）模式；离子源温度600℃；离子源电压5 500 V；雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气均为高纯氮气，质谱优化条件见表2。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

有机磷农药残留检测中常用的提取溶剂有丙酮、乙酸乙酯和乙腈，因乙酸乙酯不溶于水，不可以直接作为溶剂供液质联用仪检测，所以提取溶剂优先选择丙酮和乙腈。丙酮作为提取溶剂时得到的提取液会含有更多的共萃物[15]，不易净化，所以《食品中有机磷农药残留量的测定》（GB/T 2009.20-2003）和《植物源性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》（GB/T 5009.145-2003）采用丙酮作为提取溶剂的国家标准均加入了繁杂的固相萃取净化步骤。 而乙腈作为一种极性有机溶剂，其优点是糖类、蛋白质和大多数亲脂性物质不会被提取，渗透性强，对大多数有机磷农药具有良好的溶解性。本试验主要采用稀释法降低基质减弱效应对检测灵敏度的影响，达到快速、简便和准确性高的目的，选择乙腈作为提取溶剂，并在乙腈中添加1%乙酸作为类分析保护剂。

2.2 净化条件的选择

本试验方法同时检测了极性较大的有机磷农药品种，如甲胺磷、敌百虫和极性相对较小的品种，如甲基嘧啶磷等，其中甲胺磷和敌百虫等易降解，所以给净化方式造成了一定难度。因考虑到实验操作时间过长对易降解农药回收率的影响，本试验分别考察了QuEChERS的前处理方法和直接稀释法的净化效果，结果表明QuEChERS中使用PSA对样品净化时在吸附了极性杂质的同时对甲胺磷和敌百虫也有不同程度的吸附，而直接稀释法虽然存在一定程度的杂质干扰和基质效应，但是在色谱图上显示杂质可与9种有机磷农药的保留时间完全分离。

2.3 色谱条件的优化

分别考察了水、0.1%甲酸水溶液、0.005 mol/L乙酸铵水溶液对峰形、响应值等影响。结果表明：以甲醇-水或乙腈-水作为流动相时回收率和响应值均不高；在对0.005 mol/L乙酸铵水溶液和0.1%甲酸水溶液进行比较时发现，0.1%甲酸水溶液能让峰形更尖锐，响应值更高。因待测液溶剂为纯乙腈，在色谱分离时有溶剂效应的影响，峰形分叉，响应值低，见图1。在变换流动相比例不能对峰形和响应值达到优化效果的情况下，本试验尝试降低进样量，结果证明峰形均变得尖锐，响应值增加，见图2。

2.4 质谱条件的确定

将9种有机磷农药的混合标准品采用针泵直接流动注射进样，采用正离子模式进行一级质谱分析，确定待测物的分子离子峰， 确定了待测物的分子离子质荷比后，通过碰撞气将分子离子击碎，碎片进入二级质谱分析，得到子离子的质谱图。通过多反应离子检测（MRM），选择相对丰度较高的一组离子作为定量离子对，另一组作为定性离子对。同时对电喷雾电压、雾化气压力、气帘气压力、辅助气流速、碰撞气流速、离子源温度、碰撞室出入口电压和去簇电压等参数进行了优化。详见表2。

2.5 方法线性范围、精密度和回收率试验

准确吸取0.1 μg/mL的9种有机磷混合标准溶液20、50、80、100、200 μL，分别用基质提取液定容至1 mL，得到浓度为2、5、8、10、20 ng/mL的9中有机磷混合标准工作液。依次进样，分别以峰面积Y为纵坐标，相应的浓度值X为横坐标，作标准曲线。以槟榔样品作为基质，分别对其添加低、中、高3个水平的9种有机磷农药标样，每个添加浓度做6个平行试验，用于考察本方法的回收率和精密度。结果见表3。

由表3可知，9种有机磷农药在2～20 ng/mL范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r均大于0.999。符合《实验室质量控制规范》（GB/T 27404-2008）中对校准曲线的相关系数不低于0.99的要求。《实验室质量控制规范》（GB/T 27404-2008）规定，添加水平100 μg/kg时，回收率范围应在60%～120%，添加水平在100～1 000 μg/kg时，回收率范围应在80%～110%。添加水平在0.1 μg/kg～1 mg/kg时，变异系数范围应在43%～11%。由表3可知，结果符合检测方法确认的技术要求。

2.6 样品检测

对海南9个市售品牌的食用槟榔样品进行有机磷农药残留检测，9个样品均未检出有机磷农药残留。试验结果证明，试验所用食用槟榔样品并未非法添加甲胺磷，因有机磷农药易降解，种植过程引入的有机磷农药残留可能经过食用槟榔复杂的生产加工工序完全降解。

3 结论

本试验采用直接稀释法对槟榔样品进行前处理，样品基质提取液配置标准曲线，建立了食用槟榔中9种有机磷农药含量的液质联用检测方法。方法采用1%乙酸-乙腈作为提取液，提取液直接稀释后供仪器检测。以实际检测时的信噪比（S/N）为3，计算本方法的检出限为50.0 μg/kg。

结果表明，直接稀释法是一种有效的样品前处理方法。方法通过对提取液的稀释，降低了干扰成分的浓度，提高待测组分离子化的竞争力，减弱基质效应。同时，方法克服了不同品种有机磷农药因极性不同而无法同时采用吸附净化剂的问题，适用范围更加广泛。相较其它的农残分析方法，直接稀释法具有节省溶剂、低检测成本、操作简便、分析速度快等优点。本研究方法提取液经过稀释，减小基质减弱效应，谱图中杂质峰均与待测组分峰分离。该分析方法操作简便，效率高，准确且重现性好，适用于食用槟榔中有机磷农药的含量测定。

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