基于网络药理学和分子对接技术探究盐地碱蓬抗乳腺癌的机制

凌存保 赵小芳 樊伟平 陈文艳 杜欣娜

【摘要】 目的 應用网络药理学方法和分子对接技术探讨盐地碱蓬的活性成分对于乳腺癌辅助治疗的潜在机制。方法 通过文献研究结合中药系统药理学数据库和分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）筛选出盐地碱蓬的主要药效成分，通过SwissTargetPrediction数据库对药效成分的靶标进行预测。同时，通过查询GeneCards网站和DisGeNet数据库得到乳腺癌的相关靶点。将药物和疾病的靶点进行匹配，得到共同靶点列表，之后将列表导入STRING在线分析平台，构建分子靶点蛋白之间的互作网络，利用cytoscape3.8.0软件进行可视化并筛选核心靶点。通过R软件进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，运用AutoDock Vina和Pymol将有效成分与核心靶标进行分子对接。结果 盐地碱蓬主要的药效成分有3种，与乳腺癌相关的靶点有179个。GO分析显示靶点主要集中在上皮细胞增殖的调控、氧化应激反应、ERK1和ERK2下游信号通路等。KEGG分析得到富集通路主要是与肿瘤发生发展相关的通路，如MAPK信号通路、内分泌抵抗信号通路、乳腺癌信号通路等。分子对接显示3种活性成分与关键靶点具有较好结和力。结论 盐地碱蓬的主要活性成分可能通过多靶点调节多条信号通路辅助干预乳腺癌。本研究可为后期抗肿瘤药物开发提供参考。

【关键词】 盐地碱蓬；活性成分；网络药理学；乳腺癌；分子对接

Systematic elucidation of the pharmacological mechanisms of Suaeda salsa for treating breast cancer via network pharmacology

Ling Cunbao，Zhao Xiaofang，Fan Weiping，Chen Wenyan，Du Xinna. Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng，Jiangsu 224005

【Abstract】 Objective To uncover the potential effective components and mechanism of Suaeda salsa in the treatment of breast cancer based on network pharmacology. Methods The effective components of Suaeda salsa were retrieved from other articles and screened by tcmsp. The corresponding targets of the effective components were collected from the SwissTargetPrediction website. Targets of breast cancer were collected from GeneCards and DisGeNet databases. The intersection of Suaeda salsa target genes and breast cancer target genes was performed using the “VennDiagram” package in R software. Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analyses of the targets were performed via R software. Cytoscape software was used to construct a compound network. A protein-protein interaction （PPI） network was generated by using the STRING database. Key targets were filtered by utilizing the CytoNCA plugin. Molecular docking analysis was used to check the affinity of active ingredients to the central targets. Results The results revealed that there were 3 active compounds of Suaeda salsa which have 179 targets associated with breast cancer. GO analysis suggested that these targets were significantly enriched in factors associated with regulation of epithelial cell proliferation， oxidative stress and ERK1 and ERK2 cascade， etc. KEGG pathways mainly involved cancer-related pathways such as the MAPK signaling pathway and endocrine resistance and breast cancer. The results of molecular docking showed that the active compounds had a high affinity with the core targets. Conclusion The present study demonstrates that Suaeda salsa exerts therapeutic effects in breast cancer through multiple targets and pathways and provides evidence to support its potential development as a promising Chinese medicine.

【Key Words】 Suaeda salsa； Active ingredient； Network pharmacology； Breast cancer； Molecular docking

中图分类号：R737.9        文献标识码：A        文章编号：1672-1721（2023）34-0001-06

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.34.001

由于人类生存环境的变化、生活习惯的改变和社会压力的增大，近年来乳腺癌发病率逐年增加，且乳腺癌呈现出发病年轻化趋势，严重影响人类的身心健康，甚至危及患者生命[1]。乳腺癌药物治疗主要包括化疗、生物治疗和内分泌治疗[2]。许多药物在治疗肿瘤的同时也不可避免带来不良反应，包括骨髓抑制和免疫功能低下、心脏损伤等[3]。近几年开发出一些乳腺癌靶向治疗的药物，取得较好的疗效，但由于肿瘤细胞的异质性，很多患者会产生耐药性[4]。因此，研究高效、安全的新型抗肿瘤药物已成为当今药物研发的重要方向，来自于天然植物的活性成分的医学价值也逐渐被人们认识。

盐地碱蓬是一年生藜科植物，又名盐蒿菜、盐蓬，在我国主要分布于沿海海滩的沙地和盐碱地。盐地碱蓬中含有丰富的生物碱、黄酮、蛋白质、酚醌、多糖类等化合物，具有很多药用价值，如降糖、抗感染、抗氧化、抗癌、防治心脏病、增强人体免疫力等[5]，但长期以来，盐地碱蓬并未得到人们的重视，为更充分挖掘它的食用和药用价值，故开展本研究。本研究通过中药数据库查询、网络药理学、生物信息学技术分析盐地碱蓬治疗乳腺癌潜在靶点和机制，为治疗乳腺癌提供理论基础，为药物开发提供参考。

1 资料和方法

1.1 盐地碱蓬的活性成分和相应靶点筛选 通过文献调查，得到盐地碱蓬的主要活性成分。登录中药系统药理学数据库和分析平台（ TCMSP）查询各活性成分的药代动力学特性。筛选出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類药性（drug-likeness，DL）≥0.18的活性成分。从PubChem网站（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的2D分子结构图，并以标准延迟格式（standard delay format，SDF）保存。在SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）上传活性成分的2D结构SDF文件，根据化学结构获得预测靶点。随后使用UniProtKB数据库（https：//www.uniprot.org/）将靶点名转换为相应的基因名称。

1.2 乳腺癌相关的基因和治疗靶点 以“breast cancer”为检索关键词从GeneCards网站（https：//www.genecards.org/）和DisGeNet数据库（https：//www.disgenet.org/search）获取乳腺癌的相关的靶基因列表。登录UniProtKB数据库，物种选择“Homo sapiens”，对上述所有目标的基因名称进行标准化。使用R软件的“VennDiagram”包（Windows的3.6.0版本）将盐地碱蓬靶基因和乳腺癌靶基因取交集，生成一个维恩图和基因列表。

1.3 GO分析和KEGG富集通路分析 获取重叠靶基因列表后，使用R语言的clusterprofiler包进行GO和KEGG通路富集分析，并进行可视化。GO富集分析包括了生物过程（bioprocess，BP）、细胞成分（cell composition，CC）和分子功能（molecular function，MF），以错误发现率（false discovery rate，FDR）校正的P值<0.05为差异有统计学意义，结果以柱形图展示。此外，根据富集到某通路里靶基因占总基因比例排名和P值大小，筛选前20个关键的KEGG信号通路（P<0.01为差异有统计学意义），结果以气泡图展示。

1.4 构建药物-成分-疾病-靶点-通路网络 为了更清晰直观表示盐地碱蓬治疗乳腺癌的多成分、多靶点和多通路机制，使用cytoscape3.8.0软件构建药物-成分-疾病-靶点-通路复合网络。用不同颜色和形状的节点分别代表药物、成分、疾病、靶基因或相关信号通路。

1.5 构建蛋白-蛋白相互作用网络（protein-

protein interactions，PPIs）并筛选核心靶点 将获取的靶基因列表导入到STRING数据库（https：//string-db.org/）从而构建蛋白-蛋白相互作用网络（PPIs）。物种设置为人类，目标列表中保留综合得分>0.9的PPIs进行进一步分析，下载TSV格式的蛋白相互作用文件，导入Cytoscape3.8.0软件，进行可视化。节点和边分别代表蛋白和蛋白之间的相互作用。不与网络中其他蛋白质相互作用的孤立蛋白质被移除。利用CytoNCA插件计算各个节点蛋白质的3个关键拓扑学参数：度中心性（degree centrality，DC）、中间性中心性（betweeness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）。3个参数值都大于所有节点的中位数的蛋白质被认为有核心作用。

1.6 药物主要成分和关键靶点的分子对接 从RSCB数据库（http：//www.rcsb.org/）下载代表性核心蛋白的pdb结构式，使用AutoDock Tools软件去除核心蛋白结构中水分子，再加氢，并计算电荷，保存为pdbqt格式。从PubChem数据库获取盐地碱蓬3种活性成分的2D和3D结构的SDF文件。用Pymol软件进行蛋白分子结构处理，上传活性成分的小分子结构，接着使用AutoDock vina进行分子对接，计算结合能。结合能越小说明配体和受体结合越稳定，越可能发生相互作用。最后使用Pymol 2.4软件（https：//pymol.org/2/）对所得对接结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 盐地碱蓬活性成分及靶点 按照方法1.1的步骤操作后，得到盐地碱蓬所含符合口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18的活性成分共3个，包括胡萝卜甾醇（daucosterol）、槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol），相应的TCMSP编号和分子结构见表1、图1、图2、图3。在pubmed数据库下载3种活性成分的2D结构图，上传至swisstarget prediction数据库，预测其作用靶点。结果显示胡萝卜甾醇的潜在作用靶点有100个，槲皮素的潜在作用靶点有100个，β-谷甾醇潜在作用靶点有38个。去除3组之间重复的靶点后，共得到209个靶点，提示盐地碱蓬各成分之间的作用可能具有协同机制。

2.2 盐地碱蓬和乳腺癌共同靶点 以“breast cancer”为检索关键词从DisGeNet数据库和GeneCards网站分别获取到乳腺癌的相关的靶基因766个和7 786个。用R软件进行取交集操作后得到两个数据库共同的靶基因6 010个，见图4（a）。这6 010个乳腺癌相关靶点和盐地碱蓬的209个靶点之间的共同靶点有179个，结果以韦恩图展示，见图4（b）。

2.3 GO和KEGG通路分析结果 对得到的共同靶点用方法1.3进行GO和KEGG分析。GO分为生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3类。富集到的生物学过程（BP）有1 810个，细胞组分（CC）共30个，分子功能（MF）共97个。根据P值从小到大排列，用柱形图的形式分别展示富集效应最明显的前10个GO条目，见图5（a）。显著富集的生物过程包括上皮细胞增殖（epithelial cell proliferation）、对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）、上皮细胞增殖的调控（regulation of epithelial cell proliferation）、氧化应激反应（response to oxidative stress）、ERK1和ERK2下游信号通路（ERK1 and ERK2 cascade）等。细胞组分主要包括膜脂质筏（membrane raft）、膜微区域（membrane microdomain）、RNA聚合酶II转录因子复合物（RNA polymerase II transcription factor complex）等。分子功能主要涉及磷酸化结合（phosphatase binding）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、蛋白激酶活性调控（protein phosphatase binding）等。可见活性成分干预乳腺癌可能与上皮细胞增殖、细胞因子受体结合通路有关。

KEGG信号通路富集分析共显示富集到137个信号通路，以气泡图展示P值最小的20个信号通路，见图5（b），主要包括癌症相关的蛋白多糖信号通路，MAPK信号通路、癌症中的microRNA信号通路、膀胱癌信号通路、内分泌抵抗信号通路、乳腺癌信号通路、TNF信号通路等。以上多条信号通路均与肿瘤发生发展相关，包括MAPK信号通路、microRNA信号通路、内分泌抵抗信号通路、乳腺癌信号通路、TNF信号通路等。盐地碱蓬可能通过肿瘤发生发展相关信号通路发挥抗癌的功能。

2.4 構建药物-成分-疾病-靶点-通路网络 为了更清晰直观表示盐地碱蓬治疗乳腺癌的潜在机制，用cytoscape软件3.8.0构建药物-成分-疾病-靶点-通路复合网络，见图6。结果表明盐地碱蓬可能通过多靶点和多途径对乳腺癌进行辅助治疗。

2.5 构建PPI网络并筛选核心靶点 将靶基因列表导入到STRING数据库构建了蛋白-蛋白相互作用网络（PPIs）。下载蛋白互作信息的TSV格式文件，导入Cytoscape3.8.0软件进行可视化。不与网络中其他节点相互作用的独立蛋白质被移除，结果见图7（a）。利用CytoNCA插件计算各个节点的3个关键拓扑学参数DC、BC、CC。3个参数值都大于所有节点的中位数的蛋白质被认为有核心作用。经过2次筛选，见图7（b）（c）（d），得出网络中的核心蛋白有21个，见图7（e），主要包括AKT1、MAPK1、TP53、EGFR、CASP3等。

2.6 盐地碱蓬活性成分与核心靶点的分子对接结果 分子对接结果显示胡萝卜甾醇、槲皮素、β-谷甾醇与代表性核心靶点MAPK1、EGFR结合力较好，结合能均小于-7 kJ/mol，结合构象比较稳定，见封三图8（a）和图8（c）、图9（a）和图9（c）、图10（a）和图10（c）。

计算机模拟发现胡萝卜甾醇、槲皮素、β-谷甾醇主要通过氢键和疏水作用结合在目标蛋白的表面口袋中，见封三图8（b）和图8（d）、图9（b）和图9（d）、图10（b）和图10（d）。图中，紫色表示靶蛋白，粉色表示蛋白与活性成分结合的氨基酸残基，绿色表示活性成分，黄色虚线表示氢键。胡萝卜甾醇可以与EGFR的第1位的天冬氨酸、第46位的亮氨酸残基和61位的天冬酰胺形成稳定的氢键。槲皮素可以和MAPK1蛋白的31号异亮氨酸残基、54位和114位的赖氨酸残基、108号甲硫氨酸残基、166位半胱氨酸残基和107号天冬氨酸残基结合。

3 讨论

盐地碱蓬是一种生存能力强、分布范围广的一年生草本植物，含有多种生物活性物质，具有很广阔的开发前景。本研究论证了盐地碱蓬中主要活性成分对乳腺癌的潜在治疗作用。经过文献调查和中药TCMSP数据库查询，得出盐地碱蓬中的槲皮素、胡萝卜甾醇、β-谷甾醇是具有药物活性的主要成分。

槲皮素属于天然植物来源的黄酮类化合物，在盐地碱蓬中的含量较高，对多种疾病具有治疗和缓解功效，包括恶性肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病和氧化应激相关疾病[6-7]。在满足一定的剂量和时间条件下，槲皮素具有抗氧化特性，使细胞的氧自由基和抗氧化物质达到平衡，抑制乳腺癌的发生发展[8]。本研究发现盐地碱蓬对乳腺癌的靶点富集于氧化应激反应（response to oxidative stress）过程。槲皮素可以抑制Her-2介导的信号通路，从而减轻肿瘤细胞对他莫昔芬的耐药性[9]。槲皮素通过促进Foxo3a信号蛋白及其上游蛋白（JNK）的活性来增加凋亡和细胞周期阻滞，从而抑制肿瘤的发生发展[10]。本研究发现盐地碱蓬抗乳腺癌的靶点有部分富集于磷酸化途径和蛋白激酶活性调节等，与信号蛋白激活有关。为了提高槲皮素的溶解度、生物利用度、循环时间和人体内的靶向性，科学家正致力于开发新型可生物降解和相容性载体作为给药系统，包括基于脂质体、壳聚糖等[8]。

β-谷甾醇和胡萝卜甾醇属于天然植物来源的甾醇类化合物，在医药学上有很广泛的使用。β-谷甾醇和胡萝卜甾醇具有抗乳腺癌作用。细胞实验和动物实验表明胡萝卜甾醇抑制了乳腺癌转移，减少了转移灶数量[11-12]，它通过ROS依赖性的方式诱导自噬，抑制癌细胞增殖，有望成为一种抗癌药物[13]。本研究发现显著富集的生物过程包括上皮细胞增殖、上皮细胞增殖的调控、ERK1和ERK2下游信号通路等，这些均与乳腺癌细胞的增殖转移相关。β-谷甾醇具有抗肿瘤特性和癌症治疗潜力[14]。有文献报道，β-谷甾醇对体外培养的乳腺癌细胞具有抗增殖和促凋亡作用，可以使乳腺癌细胞阻滞在G1期[15]。

对靶点的网络拓扑学分析得出核心靶点有21种，主要包括AKT1、MAPK1、TP53、EGFR、CASP3等。以MAPK1和EGFR为例进行研究。有研究报道，MAPK1高表达和高磷酸化激活状态促进了乳腺癌的发生和转移[16]，与乳腺癌的转移和预后不良有关[17]。MAPK1/3激酶促进ULK1降解，并促进乳腺癌骨转移[18]。长非编码RNA LINC00473作为一种竞争性内源性RNA，通过miR-198减少MAPK1的表达，达到抑制乳腺癌的效果[19]。EGF是一种表皮生长因子，与EGF受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的结合可促进细胞的存活和增殖。表皮生长因子受体（EGFR）在大多数三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中高表达，这可能为精准治疗提供一个潜在的靶点。用钕、紫杉醇（paclitaxel，PTX）和西妥昔单抗（Cetuximab，Cet）结合制作纳米复合物，可与EGFR特异性结合，进行靶向治疗，可促进EGFR高表达TNBC的细胞凋亡和肿瘤生长抑制[20]。本研究通过分子对接可发现盐地碱蓬的活性成分与乳腺癌关键靶点结合力较好。为盐地碱蓬抗乳腺癌提供了线索和参考，有利于盐地碱蓬药用和食用价值的开发。为了进一步证明其功效，后面还需要更多分体外和体内实验验证。

参考文献

[1] SIEGEL R L，MILLER K D，FUCHS H E，et al.Cancer statistics，2021[J].CA Cancer J Clin，2021，71（1）：7-33.

[2] MOO T A，SANFORD R，DANG C，et al.Overview of breast cancer therapy[J].PET Clin，2018，13（3）：339-354.

[3] PAPLOMATA E，ZELNAK A，REGAN R. Everolimus：side effect profile and management of toxicities in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2013，140（3）：453-462.

[4] BORDONARO S，BERRETTA M，TRALONGO A C，et al.The real impact of target therapy in breast cancer patients： between hope and reality[J].Curr Cancer Drug Targets，2018，18（5）：480-498.

[5] 張国伟，田春雨，王自善，等.盐地碱蓬的化学成分、药理作用及开发利用[J].中医临床研究，2021，13（3）：120-122，136.

[6] KASHYAP D，GARG V K，TULI H S，et al.Fisetin and quercetin：promising flavonoids with chemopreventive potential[J].Biomolecules，2019，9（5）：174.

[7] 郭丽霞，宁寰宇，曹苇，等.RP-HPLC法同时测定翅碱蓬中四种黄酮化合物的含量[J].海洋科学，2020，44（4）：111-115.

[8] KASIRI N，RAHMATI M，AHMADI L，et al.Therapeutic potential of quercetin on human breast cancer in different dimensions[J].Inflammopharmacology，2020，28（1）：39-62.

[9] WANG H，TAO L，QI K，et al.Quercetin reverses tamoxifen re-sis-tance in breast cancer cells[J].J BUON，2015，20（3）： 707-713.

[10] 罗玉婷，林龙飞，刘宇灵，等.基于网络药理学及分子对接技术探讨半夏泻心汤治疗结肠癌潜在分子机制[J]2020，45（23）：5753-5761.

[11] HAN B，JIANG P，LIU W，et al.Role of daucosterol linoleate on breast cancer：studies on apoptosis and metastasis[J].J Agric Food Chem，2018，66（24）：6031-6041.

[12] JIANG P，HAN B，JIANG L M，et al. Simultaneous separation and quantitation of three phytosterols from the sweet potato，and determination of their anti-breast cancer activity[J].JPharm Biomed Anal，2019，174（10）：718-727.

[13] ZHAO C，SHE T，WANG L，et al. Daucosterol inhibits cancer  cell proliferation by inducing autophagy through reactive oxygen species-dependent manner[J].Life Sci，2015，137（15）：37-43.

[14] PRADHAN M，SURI C，CHOUDHARY S， et al.Elucidation of the anticancer potential and tubulin isotype-specific interactions of β-sitosterol[J].J Biomol Struct Dyn，2018，36（1）：195-208.

[15] VUNDRU S S，KALE R K，SINGH R P.β-Sitosterol induces G1 arrest and causes depolarization of mitochondrial membrane potential in breast carcinoma MDA-MB-231 cells[J].BMC Complement Altern Med，2013，13：280.

[16] RAMIREZ-ARDILA D，TIMMERMANS A M，HELMIJR J A，et al.Increased MAPK1/3 phosphorylation in luminal breast cancer related with PIK3CA hotspot mutations and prognosis[J].Transl Oncol，2017，10（5）：854-866.

[17] HAMADNEH L，BAHADER M，ABUARQOUB R，et alPI3K/AKT and MAPK1 molecular changes preceding matrix metallopeptidases overexpression during tamoxifen-resistance development are correlated to poor prognosis in breast cancer patients[J].Breast Cancer，2021，28（6）： 1358-1366.

[18] DENG R，ZHANG H L，HUANG J H，et al.MAPK1/3 kinase-dependent ULK1 degradation attenuates mitophagy and promotes breast cancer bone metastasis[J].Autophagy，2021，17（10）：3011-3029.

[19] NIU L，ZHOU Y，ZHANG W，et al.Long noncoding RNALINC00473 functions as a competing endogenous RNA to regulate MAPK1 expression by sponging miR-198 in breast cancer[J].Pathol Res Pract，2019，215（8）：152470.

[20] LIAO W S，HO Y，LIN Y W，et al.Targeting EGFR of triple-negative breast cancer enhances the therapeutic efficacy of paclitaxel- and cetuximab-conjugated nanodiamond nanocomposite[J].Acta Biomater，2019，86：395-405.

（收稿日期：2023-09-22）