基于网络药理学分析丹参山楂组分配伍抗动脉粥样硬化的作用机制研究

张建永 王岚 梁日欣 杨滨

[摘要]該文基于网络药理学预测及体外细胞验证的方法，对丹参山楂有效组分配伍（SC121）抗动脉粥样硬化（AS）的作用机制进行了探讨。根据SC121所含成分的结构类型及药效活性报道，选取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹参素、表儿茶素及原花青素B2作为SC121的主要活性成分，用于网络药理学分析。运用TCMSP数据库，筛选上述5个主要成分作用于心血管疾病的网络靶点；结合KEGG和Uniprot数据库，进行信号通路和生物途径分析，预测其作用机制。 在网络药理学预测的基础上，建立体外细胞模型，观察SC121对oxLDL诱导人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）和巨噬细胞RAW2647损伤及泡沫化的保护作用。网络分析结果显示，SC121可通过作用同一靶点或不同靶点发挥抗AS作用， 其作用机制与调节PPAR，reninangiotensin system等多通路，参与炎症反应、内皮细胞保护及脂质生物合成和代谢等多生物途径有关。细胞实验结果表明，SC121可减轻oxLDL对HUVEC和RAW2647的损伤程度， 降低RAW2647细胞内活性氧水平，减少泡沫细胞面积，并呈一定的量效关系。即在体外细胞模型上，SC121可抑制内皮细胞损伤、抗氧化等，验证了网络药理学的预测结果，综合阐释了SC121抗AS的作用机制。

[关键词]丹参山楂有效组分配伍； 动脉粥样硬化； 网络药理学； HUVEC； RAW2647； 泡沫细胞

Explore antiatherosclerotic mechanism of component compatibility of

Danshen and Shanzha based on network pharmacology and cell level

ZHANG Jianyong1， 2， WANG Lan1， LIANG Rixin1*， YANG Bin1*

（1 Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2 Pharmacy School， Zunyi Medical university， Zunyi 563009， China）

[Abstract]To explore the antiatherosclerotic mechanism of active component compatibility of Danshen and Shanzha （SC121） based on network pharmacology and in vitro research validation with cell model On one hand， according to the chemical structures and pharmacological activities of the compounds reported in Danshen and Shanzha， 5 compounds， ie， salvianolic acid B， tanshinone ⅡA， tanshinol， epicatechin and procyanidin B2 were chosen and used for network pharmacology analysis Then the TCMSP（http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp）was used for finding the network targets for 5 compounds from SC121 The signaling pathway associated with cardiovascular disease was analyzed by KEGG mapping， the biological process associated with cardiovascular disease was analyzed by Uniprot And， the mechanism of SC121 was predicted by network pharmacology In vitro cell model was subsequently performed for validation HUVEC and RAW2647 cell injuries and foam cell formation were constructed by oxLDL， and the intervention effects of SC121 were assayed The result showed that SC121 not only alleviated the damage of HUVEC and RAW2647， lowered the ROS level， but also decreased the area of foam cell in a dosedependent manner， which indicated that SC121 could inhibit the damage of endothelial cells and lower the oxidative stress The experimental data validated the prediction of network pharmacology， and elucidated the mechanism of SC121′s effect on AS

[Key words]active component compatibility of Danshen and Shanzha； atherosclerosis； network pharmacology； HUVEC； RAW2647； foam cells

doi：10.4268/cjcmm20162319

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为许多心血管疾病的病理基础， 是一个复杂的进展性的病变过程，其发展过程包括了血管内皮细胞功能障碍、巨噬细胞激活和平滑肌增殖和迁移等因素参与[1]。研究表明，在AS发生的早期阶段，在各种致病因素的诱发下，血管内皮细胞会释放一系列黏附因子和趋化因子，促使血循环中的单核细胞黏附到血管壁，发生细胞黏附，迁移至血管内膜，分化成巨噬细胞，进而形成AS样脂肪纹[2]。另一方面，巨噬细胞的激活也在AS发展过程中起到关键的作用，巨噬细胞被激活后，其引发的细胞毒和炎性反应将被扩大，产生大量的自由基和炎性因子[3]。因此，干预早期AS样变化的血管内皮细胞和巨噬细胞对于抑制AS发展具有一定意义。

丹参山楂有效组分配伍（SC121）是课题组在前期工作的基础上设计的组分中药方，由丹参水溶性提取物（DSA）、丹参脂溶性提取物（DSF）、山楂水溶性提取物（SZA）组成。整体动物实验结果表明，SC121可减缓AS大鼠的病变过程，其作用机制可能与降低AS大鼠的血脂水平，增强机体抗氧化，保护内皮细胞及抗炎作用等有关[4]。网络药理学是从系统水平研究药物作用规律和机制的一种有效手段，已广泛应用于心脑血管疾病复方药物的研究，为中药复杂作用机制研究提供了新的思路[5]。众多的研究结果表明，oxLDL是诱导血管内皮细胞损伤的主要因素，可诱导产生黏附因子，导致白细胞聚集，加速AS的发展[6]。同时oxLDL可被巨噬细胞识别后吞噬，加重巨噬细胞的负担，形成泡沫细胞，是AS早期的典型病理变化[7]。因此，本研究首先采用网络药理学方法，分析丹参山楂组分配伍的作用机制，在此基础上采用oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞 （human umbilical vein endothelial cells， HUVEC）和RAW2647损伤模型进行验证，旨在明确SC121抗 AS 的作用机制，为SC121的深入开发研究提供线索。

1材料

小鼠RAW2647巨噬细胞系（中国医学科学院细胞库）；HUVEC（中国中医科学院中药研究所崔红玉惠贈）；SC121[4]（取丹参水溶性提取物84 mg、丹参脂溶性提取物25 mg、山楂水溶性提取物128 mg， 混匀即得，自制）；Hyclone DMEM高糖培养基（批号NWK0484，美国Thermo公司）；胎牛血清（批号121005，美国Gibco公司）；谷氨酰胺（Sigma公司，北京鼎国生物技术发展中心分装）；025%胰酶（批号1155732，美国Gibco公司）；DMSO （ACS级，美国Amereso公司）；MTT（Sigma 公司，北京科海荣京生物技术科技发展有限公司分装）；oxLDL（批号20121007，质量浓度1 g·L-1，北京协生生物技术有限公司）；H2O2（批号LE60M12，北京J&K Scientific公司）；油红O（Sigma公司，北京科海荣京生物技术科技发展有限公司分装）；DCFHDA ROS试剂盒（批号20120920，南京建成生物工程研究所）。

Varioskan Flash酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；SWCF2FD双人单面超净工作台（苏州净化设备厂）；MCO15AC型CO2培养箱（日本Sanyo公司）；CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；H2SH型恒温水浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；LDZ408型离心机（北京医用离心机厂）。

2方法

21网络药理学分析

211成分的选择SC121由丹参水溶性提取物、丹参脂溶性提取物和山楂水溶性提取物组成。以丹酚酸B为代表的丹酚酸类成分和以丹参酮ⅡA为代表的丹参酮类成分分别是丹参水溶性和脂溶性提取物的主要化学成分及药效成分[8]；表儿茶素和原花青素B2是山楂水溶性提取物的主要化学成分及药效成分[910]；另外，丹酚酸类成分易水解生成丹参素。故在本研究中，将丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹参素、表儿茶素及原花青素B2作为SC121的主要活性成分，用于网络药理学分析。

212网络靶点分析将上述5个成分代入TCMSP数据库（http：//lspnwsuafeducn/tcmspphp#），TCMSP是一个全面的中药成分系统药理学数据库，用于查询作用靶点等信息[11]。在TCMSP中获取作用靶点，剔除非人源靶点，采用PharmGKb（https：//wwwpharmgkborg/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（http：//www.drugbank.ca/）等数据库对网络靶标进行确认，获得SC121抗AS的网络靶点群。采用cytoscape 321构建成分靶点网络，分析SC121的作用特点。

213网络作用机制分析将上述确定的靶点带入KEGG（http：//wwwkeggjp/）进行通路分析，寻找与心血管疾病相关的通路，通过查阅文献进一步求证，构建靶点作用通路网络，同时整合Uniprot （http：//wwwuniprotorg/）中网络靶点参与的生物途径，构建靶点生物途径网络，进而综合分析SC121中5种主要成分抗AS的作用机制。

22细胞培养

221HUVEC细胞培养复苏HUVEC，接种于T25培养瓶中，加入20% FBS DEMEM培养基（含1×105 U·L-1青霉素，01 g·L-1链霉素，20 mmol·L-1谷氨酰胺），置37 ℃，5% CO2培养箱培养。次日换液，2～3 d待细胞长至融合后，以025%胰酶EDTA消化传代，常规冻存，3～8代细胞用于实验研究。

222RAW2647细胞培养RAW2647细胞以10% FBS DEMEM高糖培养基（含1×105 U·L-1青霉素，01 g·L-1链霉素，20 mmol·L-1谷氨酰胺），置37 ℃，5% CO2培养箱培养，次日换液，保持细胞密度不大于70%。实验前用倒置显微镜观察，状态良好的细胞用于实验，如细胞出现多足，则不能用于实验。

23SC121最大无毒浓度的筛选

231对HUVEC细胞的最大无毒浓度取对数生长期的HUVEC细胞，胰酶消化后以5 000个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，分别加入120，60，30，15，75 mg·L-1的SC121，作用 24 h后，MTT检测细胞存活率，以未给药组（control，ctrl）的存活率为100%，计算给药组的存活率。

232对RAW2647细胞的最大无毒浓度取对数生长期RAW2647细胞，以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，待细胞生长至70%左右，换为无血清培养12 h后，分别给予500，250，120，60，30，15，75 mg·L-1的SC121，作用24 h后，MTT检测细胞存活率，以ctrl组为对照，比较不同浓度给药后细胞的存活率。

24SC121对oxLDL诱导细胞损伤的影响

241SC121对不同浓度oxLDL诱导的HUVEC损伤的影响oxLDL造模浓度参考文献报道方法[3]，取生长状态良好的HUVEC细胞，胰酶EDTA消化，以5 000个/孔接种于96孔板中，实验分为6组（每组5个复孔）：空白对照组（ctrl组， 给予空白培养液）、oxLDL组（分别加入200，150 mg·L-1的oxLDL）、SC121组（质量浓度分别为60，30，15，75 mg·L-1），其中SC121组预先给药24 h，ctrl和oxLDL组在同等条件下给予等量的完全培养基。吸弃上清，分别加入终浓度为 200，150 mg·L-1的oxLDL，同时ctrl组给予等量的完全培养基，24 h后检测不同给药浓度的存活率。

242SC121对oxLDL诱导的RAW2647损伤的影响取对数生长期的RAW2647细胞，以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，待细胞生长至70%左右，换为无血清培养基培养12 h后，分别给予60，30，15，75 mg·L-1的SC121作用12 h，同时设ctrl组和oxLDL组，给予等量的培养液；12 h后弃上清，oxLDL组和各给药组给予 200 mg·L-1 oxLDL，ctrl組给予等量的培养液，作用12 h后弃上清，MTT检测细胞存活率。

25SC121对oxLDL诱导RAW2647细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量的影响

取对数生长期的RAW2647细胞，以4×105个/mL的密度铺至6孔板中，37 ℃过夜孵育24 h，更换成无血清的DMEM高糖培养液饥饿12 h，无菌PBS洗涤2遍，每孔加入工作浓度5 μmol·L-1的DCFHDA（将10 mmol·L-1 DCFHDA以1∶1 000稀释即得）1 mL，37 ℃孵育30 min，吸弃上清，PBS洗涤细胞2次，除去未进入细胞内的DCFHDA，分别加入60，30，15，75 mg·L-1SC121溶液预孵育6 h，吸弃上清，加入200 mg·L-1的oxLDL溶液孵育30 min后，测定相对荧光强度，计算ROS的含量。

26SC121对oxLDL诱导RAW2647泡沫细胞的影响

取对数生长期RAW2647细胞，接种于预先放入盖玻片的24孔板中，待细胞长至70%，换为无血清的培养基饥饿12 h，去掉培养基，分为6组（n=4），oxLDL组、ctrl组和4个给药组。4个给药组中分别加入无血清配制的60，30，15，75 mg·L-1的SC121溶液预作用6 h，再加入50 mg·L-1的oxLDL溶液诱导18 h。同时设ctrl组（未加oxLDL及药干预）给予无血清培养液，oxLDL组加50 mg·L-1oxLDL。收集细胞培养上清，备用。油红O染色观察巨噬细胞的脂质积累。在光学显微镜下拍照，采用Image ProPlus 60 软件计算泡沫细胞面积。

27统计学分析

实验数据以±s表示，统计分析采用SPSS 130软件，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用Ttest，以P<005被认为有显著性差异，P<001被认为有极显著性差异。

3结果

31网络药理学预测SC121的作用机制

311成分靶点网络构建及分析SC121中5个主要成分的靶点网络见图1，采用cytoscape自带分析工具network analyzer 分析，结果表明，5个成分共作用于41个与心血管疾病相关的靶点，平均每个成分118个网络靶标，其中28个独立网络靶点（仅与1个成分连接），13个网络靶点（与2～3个成分连接），即SC121具有作用于同一靶点及不同靶点的综合协同作用方式。

312靶点通路及靶点生物途径网络构建及作用机制分析将靶点代入KEGG数据库映射后，构建网络靶点信号通路网络图，见图2，发现SC121

作用的靶点中32个可映射到与心血管相关通路29个，如与心血管疾病密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor， PPAR）信号通路（PPAR siginaling pathway），花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism），肾素血管紧张素系统（reninangiotensin system）等，从网络角度揭示了SC121抗AS的作用通路。

为了全面反映不同网络靶点的作用，将41个网络靶点代入Uniprot后，构建靶点生物途径网络，见图3，提取到与心血管疾病密切相关的生物途径共8个，其中与靶点连接度高的有炎症反应（inflammatory reaction）、内皮细胞保护（endothelial cell protection）、脂质生物合成和代谢（lipid biosynthesis and metabolism）、巨噬细胞分化及泡沫化（macrophage derived foam cell differentiation）等，从网络角度揭示了SC121抗AS的多靶点、多途径的作用机制。

32SC121对HUVEC和RAW2647的最大无毒浓度筛选

MTT结果见图4，当SC121质量浓度达到120 mg·L-1时，抑制了HUVEC的生长（P<005），故选择SC121的最大无毒浓度为60 mg·L-1。类似地，质量浓度为500，250，120 mg·L-1的SC121溶液作用于RAW2647后，细胞的存活率较ctrl组显著降低（P<005）；当SC121质量浓度为60，30，15，75 mg·L-1时，可显著升高细胞的存活率（P<005），因此选择SC121的最大无毒浓度为60 mg·L-1，见图5。

33SC121对不同浓度oxLDL损伤HUVEC的保护作用

与ctrl组比较，150 mg·L-1 oxLDL可显著降低HUVEC的存活率（P<001）；预孵育24 h后，低浓度SC121 （75，15 mg·L-1） 对HUVEC存活率无明显影响；高浓度SC121 （30，60 mg·L-1） 可升高HUVEC的存活率（P<005），见图6。

36SC121对oxLDL诱导RAW2647泡沫细胞的干预作用

50 mg·L-1oxLDL作用18 h后，巨噬細胞内被染上较强的红色脂质，巨噬细胞开始变形，体积变大；SC121预干预6 h的巨噬细胞中脂质沉积显著降低，并呈明显的量效关系，见图9。采用Image ProPlus 60软件计算泡沫细胞面积，oxLDL作用18 h后，oxLDL组的泡沫细胞面积显著增加（P<001），不同浓度SC121干预后，泡沫细胞面积显著减小（P<001），并呈一定的量效关系，其中，60 mg·L-1SC121效果最显著，见图10。

4讨论

丹参山楂是治疗心血管疾病的经典药对，临床也多用其治疗心血管疾病，课题组前期实验发现，二者配伍的水合煎剂可干预大鼠AS的形成，同时可降低血脂水平，提升抗氧化能力，保护内皮细胞[12]。进一步研究发现，丹参中水溶性组分、脂溶性组分和山楂水溶性组分是其抗AS的主要成分[9]，正交设计发现3种组分不同比例配伍均具有抗AS作用，且不同配伍的作用优势不同，体现了中药作用的多途径特点，同时发现SC121是抗AS的较优配伍[4]，但其在细胞水平上的作用尚不清楚。

本研究首先采用网络药理学方法探讨了SC121中主要成分的作用机制，发现丹酚酸B等5种成分可通过共享靶点和独立靶点发挥抗AS作用，涉及到脂质代谢、内皮细胞保护、炎性反应等生物途径及通路，部分功能已被实验验证，如丹酚酸B可减轻H2O2诱导的HUVEC损伤，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活性[13]；原花青素B2可抑制脂多糖诱导的人巨噬细胞的炎症反应，同时具有较强抑制环氧合酶2活性的作用[14]。综上可知， SC121可通过多靶点、多信号通路及多生物途径的方式协同抗AS。

在上述基础上，本研究采用HUVEC和RAW2647细胞模型验证SC121的作用机制。本研究采用200 mg·L-1oxLDL诱导HUVEC损伤和RAW2647损伤，给药后发现SC121可剂量依赖性地保护oxLDL诱导的HUVEC损伤和RAW2647巨噬细胞损伤。进一步研究发现SC121可抑制损伤细胞内ROS的产生，推测其保护巨噬细胞和抑制泡沫细胞形成的作用可能与抗氧化活性相关。为了进一步探索其机制，本实验观察了SC121对RAW2647泡沫细胞的影响，在研究中首先分别以200，150，100，50 mg·L-1 oxLDL来建立RAW2647泡沫细胞模型，结果发现以200～100 mg·L-1的oxLDL建模，模型细胞损伤较大，死亡较多，且损伤后出现脂质泄露的现象，不利于观察药效，因此本研究采用50 mg·L-1oxLDL建立RAW2647泡沫细胞模型，RAW2647泡沫细胞可吞噬oxLDL，同时无泄漏发生，与文献报道的浓度相似[15]。结果表明，不同浓度SC121均可抑制RAW2647的泡沫细胞面积，且呈一定的量效关系，提示抑制泡沫细胞形成是SC121抗AS的机制之一。 综上，在体外细胞模型上，SC121可抑制内皮细胞损伤、抗炎及泡沫细胞的形成等，在细胞水平上验证了网络药理学的预测结果，对于下一步从蛋白分子水平上揭示SC121的抗AS作用机制具有重要意义。

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[责任编辑马超一]