基于网络药理学的沙棘总黄酮治疗心肌缺血的作用机制研究

魏志成　童东　杨娟　赵可惠　孟宪丽　张艺

[摘要] 该研究采用网络药理学虚拟筛选方法，旨在进一步研究沙棘总黄酮（total flavonoids of Hippophae rhamnoides，TFH）治疗心肌缺血的活性成分和作用机制。首先通过TCMSP数据库和PubChem数据库，结合口服利用度和类药性分析，筛选出沙棘化合物中的黄酮类化合物。筛选得到的7个化合物再通过ChemMapper服务器进行靶点的预测分析。将得到的潜在靶点导入MAS 3.0数据库，结合KEGG数据库进行靶点分析和通路分析。最后使用Cystoscope 3.3.0软件绘制“化合物靶点作用通路”网络图。虚拟实验预测得到了68个潜在靶点和60条信号通路，其中有31个靶点和23条通路直接或间接与心肌缺血有关。结果表明，TFH主要通过对钙离子信号通路（calcium signaling pathway）、血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）和缝隙连接信号通路（gap junction）等信号通路的调节发挥协同作用，且与文献报道吻合；提示其可能通过参与调节血小板聚集、脂质代谢、炎症反应等过程，增强心功能和对血管内皮细胞保护作用，从而发挥抗心肌缺血的作用。

[关键词] 沙棘； 沙棘总黄酮； 网络药理学； 心肌缺血； 机制研究

Action mechanism of total flavonoids of Hippophae rhamnoides in

treatment of myocardial ischemia based on network pharmacology

WEI Zhicheng， TONG Dong， YANG Juan， ZHAO Kehui， MENG Xianli， ZHANG Yi*

（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] In this study， a network pharmacological screening method was adopted to further study the active ingredients and action mechanism of total flavonoids of Hippophae rhamnoides（TFH） for the treatment of myocardial ischemia. Firstly TCMSP database and PubChem database were searched， and then the data were combined with oral bioavailability and drug analysis to screen flavonoids of H.rhamnoides compounds. Then predictive analysis was conducted for the 7 screened compounds by ChemMapper server.The obtained potential targets were imported into MAS 3.0. Database， and KEGG database was also used for targets analysis and pathway analysis. Finally Cystoscope 3.3.0 software was used to draw "compoundstargetspathway" network diagram. Virtual experiments predicted 68 potential targets and 60 signaling pathways， and 31 targets and 23 pathways of them were directly or indirectly associated with myocardial ischemia. The results showed that TFH played a synergistic rolemainly through the regulation of calcium signaling pathway， VEGF signaling pathway and gap junction signaling pathway， which was consistent with literature reports. These results indicated that it can enhance heart function， protect vascular endothelial cells， and fight against myocardial ischemia probably by regulating platelet aggregation， lipid metabolism， inflammation and other processes.

[Key words] Hippophae rhamnoides； TFH； network pharmacology； myocardial ischemia； mechanism

心肌缺血（myocardial ischemia），是指心臟的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能维持心脏正常工作的一种病理状态[1]。冠状动脉阻塞、主动脉供血减少和血压降低，可直接导致心脏供血减少；心瓣膜病、血黏度变化和心肌本身病变同样也会使心脏供血减少。其中冠状动脉阻塞是造成心肌缺血的最主要也是最常见的原因，而使冠状动脉阻塞的主要病因为冠状动脉粥样硬化。随着人民生活水平的提高，不合理的饮食习惯和生活规律使得心肌缺血在我国的患病率呈逐年上升的趋势，已成为中老年人的常见病和多发病之一，且逐年呈现年轻化的趋势。

沙棘Hippophae rhamnoides为胡颓子科酸棘属植物，是藏族习用药材，其果实可以除肺肿瘤，化血，治培根病[2]。据2015年版《中国药典》记载，沙棘有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀之功效[3]，其主要活性成分为黄酮类化合物，国内外研究表明其具有抗血栓和体外抗血小板聚集活性[4]，能改善血液流变学[5]，改善心脏功能及血流动力学[67]等影响血液系统的药理作用。以TFH为主要成分的已上市药物心达康胶囊在临床应用中也表明具有良好的抗心肌缺血和改善血流动力学作用[89]。虽然目前对TFH的药理研究已有较多报道，但针对其多成分、多靶点及多途径治疗心肌缺血的作用机制研究仍不够系统和全面。该文运用网络药理学对沙棘黄酮类成分抗心肌缺血作用机制进行系统研究，希望能为后续实验提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 TCMSP数据库（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）；PubChem（有机小分子生物活性数据库，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；ChemBioOffice2010；ChemMapper数据库（http：//lilab.ecust.edu.cn/chemmapper/index.html）；MAS 3.0（生物分子功能注释系统，http：//bioinfo.capitalbio.com/mas3/）；KEGG数据库（http：//www.genome.jp/kegg/）；Cystoscope 3.3.0。

1.2 沙棘化学成分分子库的准备 通过文献考察和TCMSP数据库（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）查询共获得了沙棘223个化学成分的分子结构。将上述223个化合物代入软件分析，通过口服利用度和类药性这2个决定药物分子是否具有较好的口服生物利用度以及成药性优劣的关键参数进行筛选[1011]。设定口服利用度（OB）≥30%，和类药性（DL）≥0.18 2个条件，得到同时符合条件个化合物有33个。这些化合物再通过PubChem（有机小分子生物活性数据库，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）进行结构辨别，筛选出2个苯环（A环与B环）通过中央三碳相互联接而成的这类化合物（黄酮类化合物），满足黄酮类结构共7个化合物分别是槲皮素（quercetin，PubChem CID：5280343）、异鼠李素（isorhamnetin，PubChem CID：5281654）、山柰素（kaempferol，PubChem CID：5280863）、花葵素（pelargonidin，PubChem CID：5281605）、表儿茶素（epicatechin，PubChem CID：72322）、儿茶素（cianidanol，PubChem CID：2353）、AC1LDVZ[（2R）5，7dihydroxy2（3hydroxy4methoxyphenyl）2，3dihydrochromen4one，PubChem CID：3593]，化合物具体信息见表1。

1.3 沙棘黄酮类化合物潜在靶点预测与筛选 用ChemBioOffice2010绘制 7个沙棘黄酮类化合物的结构，将其存为MOL2格式，并导入 ChemMapper服务器进行潜在靶点的预测分析，参数设置如下，Options for ChemMapper：Target Navigator；3D similarity method：SHAFTS；Similarity Threshold：1.2；Bioactivity Database： DrugBank。ChemMapper[12]是基于分子相似性方法的靶效药理学及化学关系发现的多功能平台，本文通过ChemMapper整合Drugbank数据库已知的包含生物活性及靶点注释信息的药物分子，然后应用三维分子相似性方法SHAFTS[13]来计算查询分子与药物分子的相似度，从而预测查询分子的潜在靶点。基于对心肌缺血发病机制的总结，进一步通过KEGG数据库靶点功能分析比对心肌缺血病理过程所对应靶点，筛选出相应的靶点进行下一步分析。

1.4 GO富集分析与通路注释 将预测获取的靶点蛋白信息导入MAS 3.0数据库，即可得到靶点的相关通路信息。参数设置如下，Species： Homo sapiens （Human）；Molecule Type： Protein；Database Symbols： Gen Bank ACC；Functions： Gene，mRNA，Protein，Pathway；Regulation Threshold： Up 2.0，Down 0.5。另外，KEGG包含的通路數据库储存了基因功能的相关信息，通过图形来表示细胞内的生物学过程。利用此数据库可以对由MAS 3.0得到的通路进行注释及GO富集分析，以及结合KEGG数据库进行通路分析。

1.5 网络构建 通过Cystoscope 3.3.0建立“化合物靶点通路”网络模式，绘制沙棘黄酮类化合物分子与靶蛋白作用网络图。以选取的7个沙棘黄酮成分、预测出的靶点和通路及通路注释为节点（node），建立相互关系，导入Cytoscape 3.3.0软件，运用network analyzer插件分析藏药沙棘黄酮类成分治疗心肌缺血的“化合物靶点通路”网络图。在网络中，以节点（node）表示活性成分、靶点和通路。以边（edge）相连接表示某一靶点为某化合物的潜在作用靶点和某一靶点与某一通路相关。

2 结果

2.1 靶点预测与筛选 通过ChemMapper数据库对TFH 7个黄酮类成分的分析，共预测得到了68个潜在靶点，经靶点功能分析后确认其中有31个靶点直接或间接与心肌缺血有关，相关靶点信息见表2。各化合物所对应的作用靶点数不尽相同，其中槲皮素14个、异鼠李素4个、山柰素14个、花葵素15个、表儿茶素24个、儿茶素10个，单从作用层次上，提示表儿茶素在网络中贡献最大。在预测的靶点中，PTGS1（前列腺素G/H合酶1）、PTGS2（环氧合酶2）是花生四烯酸代谢通路中重要节点；ADRB1（β1肾上腺素能受体），ADRB2（β2肾上腺素能受体），ADRB3（β3肾上腺素能受体），DRD1（多巴胺D1b受体），DRD5（多巴胺D1a受体）等与钙离子通道有关；MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1），MAPK14（丝裂原活化蛋白激酶14），PIK3CG（磷脂酰肌醇激酶CG），PIK3R1（磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1），PIK3R2（磷脂酰肌醇3激酶调节亚基2），CDK2（细胞分裂蛋白激酶2）等与细胞生存和凋亡有关；PIK3CG，PTGS1，PTGS2，MAPK1，IFNG（干扰素γ）等与炎症反应有关；PIK3CG，PIK3R1，PIK3R2等与脂质代谢有关。由此推断，TFH治疗心肌缺血可能通过参与调节血小板聚集、脂质代谢、炎症反应等过程，增强心功能和保护血管内皮细胞等作用有关。

2.2 GO富集分析及通路分析 通过GO富集分析发现，见图1～3，预测靶点在生物过程中，蛋白偶联受体蛋白信号通路和信号传导排位靠前；在分子功能中，ATP结合、蛋白质结合、转移酶活性和核苷酸结合相关性最大；在细胞组分中，质膜和细胞核所占比例最大。通过KEGG通路分析共得到60条信号通路，23条直接或间接与心肌缺血有关，见表3。其中有2条与血小板聚集有关，分别是Fc epsilon RI和arachidonic acid metabolism信号通路；有3条与脂质代谢相关，分别是Fc epsilon RI，mTOR和Insulin信号通路；有8条与炎症相关，分别是Tolllike receptor，MAPK，JakSTAT，Arachidonic acid metabolism，Leukocyte transendothelial migration，TGFbeta，Proteasome和Focal adhesion信号通路；有6条与细胞凋亡相关，分别是VEGF，Apoptosis，Cell cycle，p53，Gap junction和ErbB信号通路；有3条与心脏功能和血管舒张有关，分别是Ca2+，Fc epsilon RI和Phosphatidylinositol signaling system信号通路；有3条与血管韧性和通透性有关，分别是Leukocyte transendothelial migration，Adherens junction和Tight junction信号通路。

2.3 网络构建 利用Cytoscape 3.3.0软件建立了TFH的“化合物靶点通路”网络图，见图4。直观地呈现了6个化合物（其中化合物AC1LDVZP无对应靶点）、31個靶蛋白、23条作用通路与心肌缺血疾病之间的关系。分析结果表明， Calcium signaling pathway，VEGF signaling pathway和Gap junction 3条信号通路在网络中网络节点度排位靠前（作用于通路的靶点数均≥8），为网络中的枢纽节点，提示它们可能是TFH抗心肌缺血核心作用途径；化合物与靶点间存在着“一对多、多对一”的关系，体现了TFH其多成分、多靶点的抗心肌缺血作用机制；沙棘黄酮类成分在血小板聚集、脂质代谢、炎症反应、细胞凋亡和心血管功能等相关通路上具有协同作用。

3 讨论

网络药理学是在基于高通量组学数据分析、计算机虚拟计算及网络数据库检索构建 “药物基因靶点疾病”相互作用网络，进一步利用网络平衡的整体观来分析药物与机体相互作用的一门学科[14]。网络药理学的发展打破了“一个药物、一个靶标、一种疾病”的传统理念，将高选择性单一靶点的新药研究模式转化为针对机体网络调控的组合模式[15]。网络药理学这一研究策略为中药和民族药药理学研究提供了崭新的思路与方法，为中药和民族药多靶点、多途径效应提供了可量化数据，实现了对单味药多成分或者复方的作用机制研究的整体化、系统化[16]。

心肌缺血主要由于血液所含物质的变化和血管腔内产生病理改变的结果[1]。大多起因于膳食不合理、运动过少等生活因素导致的高脂血症、高胆固醇血症。久而久之导致动脉血管形成粥样斑块，而冠状动脉粥样硬化直接造成冠状动脉血管通道变得狭窄，甚至阻塞，这也是心肌缺血最主要和常见的原因之一[17]。藏医理论认为，心是脏腑之君，《四部医典》[18]对心脏病的病因描述为“愁悲烦乱心不安，腹肌失眠瞋粗暴生”。心肌缺血的症状属于藏医“心悸”“心刺痛”“心热症”等病的范畴[19]，而冠状动脉粥样硬化所导致的心肌缺血，藏医认为，一些病因一方面会使隆行太过发生偏盛的病变，或隆乱血塞；另一方面作用于血使赤巴受害而打破三因平衡[20]。

本研究发现大量预测靶点与血管内皮细胞保护和心肌细胞保护有关，且各个靶点、通路相互协同作发挥作用，提示这可能是TFH抗心肌缺血的关键。心肌缺血/再灌注损伤引起炎症反应，大量炎症介质的表达，造成心肌细胞的进一步凋亡，从而加剧心肌缺血/再灌注损伤[21]。另一方面，血小板聚集、炎症反应、氧化应激反应会进一步损伤内皮细胞，促进血栓形成和加剧炎症反应，进而加速冠状动脉硬化和心肌缺血病理过程。花生四烯酸代谢信号通路在整个抗心肌缺血过程扮演着重要的角色，其代谢产物参与胆固醇代谢、内皮细胞单核细胞黏附、血小板聚集，调节血液黏度和血细胞功能等过程[22]；而且Src酪氨酸激酶的激活能增加细胞内钙离子水平和激活磷脂A2（PLA2），进而激活花生四烯酸在质膜磷脂中的合成[4]。TFH对活性氧自由基（ROS）的清除作用[23]能减少心肌缺血造成的损伤。心肌缺血会导致心肌细胞产生大量ROS，再灌注也会进一步促使心肌细胞产生ROS[24]，加剧心肌细胞和内皮细胞的凋亡。而TFH可能通过MAPK14，PIK3CG，PTK2B，PIK3R1和PIK3R2等靶点调控白细胞跨内皮迁移信号通路（Leukocyte transendothelial migration），抑制NADPH氧化酶表达，进而减少ROS的分泌，保护心肌细胞和内皮细胞受到氧化应激损伤。

本文通过预测得到的Calcium signaling pathway，VEGF signaling pathway和Gap junction 3个通路为网络中枢纽节点，与已有文献报道吻合，证实了预测实验的准确性。TFH对钙离子转运的影响，能增强心肌细胞的收缩力[25]和减少钙离子超载[26]造成的细胞损伤。TFH通过多个肾上腺素能受体和多巴胺受体对钙离子信号通路进行调控，提示这可能是总黄酮保护内皮细胞的机制之一。心肌和血管在缺血性缺氧环境下，机体会上调低氧诱导因子（HIF1α）的表达，诱导体内一些血管活性物质，如血管内皮生长因子（VEGF）和内皮素1（endothelin1，ET1）的表达[27]。VEGF在正常血管中无表达，但在动脉粥样硬化斑块中表达显著增加，这也是斑块形成的重要特征之一。而沙棘提取物能显著减少由缺氧诱导的促炎细胞因子和VEGF水平的增加[28]，提示TFH能通过调节VEGF信号通路上游靶点（SRC，PIK3CG，PTGS2，MAPK14等）改善机体缺血缺氧状态，从而下调VEGF的表达。缝隙连接和心律失常及细胞损伤等有着密切的关系，在心肌缺血早期给予阻断缝隙连接细胞间通讯，发现可以明显降低随后发生的心肌坏死范围[29]。已有文献报道表明，槲皮素能显著抑制缝隙连接细胞间通讯，从而达到心肌保护的作用[3031]。

TFH其主要有效成分为槲皮素、异鼠李素、山柰素等。目前TFH运用于人体主要是通过口服吸收，故在分子库的准备阶段对沙棘所含化合物进行了口服生物利用度和类药性筛选，然后共得到7个满足条件的化合物，这些化合物良好的口服生物利用度和类药性决定了它们具有很好的成药性，从药物代谢角度上看可以很好代表了TFH的药效。最后以上述7个化合物为研究对象，通过网络药理学的手段分析了上述成分可能的作用靶点及信号通路，初步揭示了其多成分、多靶点、多途径的协同效应的作用特点。本文为下一步深入研究TFH抗心肌缺血药效基础研究及机制研究提供了一定的理论依据。

[参考文献]

[1] Sheps.Lifethreatening ventricular arrhythmias in patients with silent myocardial ischemia due to coronary artery spasmNEJM[J].New Engl J Med，1992，326（22）：1451.

[2] 帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].上海：上海科技出版社，2012.

[3] 中国药典.一部[S].2015：184.

[4] Cheng J， Kondo K， Suzuki Y， et al. Inhibitory effects of total flavones of Hippophae rhamnoides L on thrombosis in mouse femoral artery and in vitro platelet aggregation[J]. Life Sci，2003，72（20）：2263.

[5] 王秉文，成华，袁秉祥，等.沙棘总黄酮对正常大鼠血液流变学的影响[J].沙棘， 2004，17（1）：28.

[6] 王秉文，冯养正，于佑民，等.沙棘总黄酮对正常人心功能及血流动力学的影响[J].西安交通大学学报：医学版，1996（4）：37.

[7] 吴英，王毅.沙棘总黄酮对急性心衰犬心功能和血流动力学的影响[J].中国中药杂志，1997（7）：429.

[8] 向楠，胡有志，石杰，等.心达康胶囊治疗冠心病心绞痛（胸痹心血瘀阻证）临床研究[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1033.

[9] 陈光宇，贾秀兰.心达康胶囊与片剂治疗冠心病（心绞痛型）181例临床疗效对比[J].中国中医急症，2000，9（6）：249.

[10] 张建永.丹参山楂组分配伍抗动脉粥样硬化及作用机制研究[D].北京：中国中医科学院，2013.

[11] Giulio Vistoli， Alessandro Pedretti， Bernard Testa. Assessing druglikeness——what are we missing？[J].Drug Discov Today，2008， 13（7/8）：285.

[12] Gong J， Cai C， Liu X， et al. ChemMapper： a versatile web server for exploring pharmacology and chemical structure association based on molecular 3D similarity method[J]. Bioinformatics， 2013， 29（14）：1827.

[13] Liu X， Jiang H， Li H. SHAFTS： a hybrid approach for 3D molecular similarity calculation. 1. Method and assessment of virtual screening[J]. J Chem Inf Model， 2011， 51（9）：2372.

[14] Hopkins A L. Network pharmacology[J]. Nat Biotechn， 2007， 25（10）：1110.

[15] Zhang Yanqiong， Mao Xia， Guo Qiuyan， et al. Network pharmacologybased approaches capture essence of Chinese herbal medicines[J]. Chin Herb Med， 2016， 8（2）： 107.

[16] Li S， Fan T P， Jia W， et al. Network pharmacology in traditional Chinese medicine[J]. Evid Based Complement Alternat Med（eCAM）， 2014， 2014（1）：57.

[17] Cocco G， Gasparyan A Y. Myocardial ischemia in Wegener′s granulomatosis： coronary atherosclerosis versus vasculitis[J]. Open Cardiovas Med J， 2009， 4（1）：57.

[18] 宇妥·元丹贡布.四部醫典（藏文）[M].拉萨： 西藏人民出版社，1982.

[19] 第司·桑杰嘉措.蓝琉璃[M].上海：上海科学技术出版社，2012.

[20] 赵可惠，王静，仁青东主，等.藏医娘塞病与中医胸痹心痛辨证治疗对比[J].时珍国医国药，2015，26（12）：2967.

[21] 董六一，陈志武.心肌缺血/再灌注损伤与炎症反应[J].中国临床药理学与治疗学，2008，13（5）：582.

[22] 郭歌，祖凌云，高炜.花生四烯酸代谢产物与动脉粥样硬化[J].心血管病学进展，2014（5）：526.

[23] 李小洁，赵保路，侯京武，等.沙棘总黄酮对活性氧自由基的清除作用[J]. 中国药理学通报，1990（2）：97.

[24] 吴蕊，凃玲.氧化应激与心血管疾病[J].心血管病学进展，2007， 28（1）：110.

[25] 王正荣，王玲，尹华虎，等.沙棘总黄酮对牵张所致心衰心肌细胞的收缩力学和钙离子转运的影响[J].航天医学与医学工程，2000， 13（1）：6.

[26] 程嘉艺. 沙棘总黄酮抗栓作用机制及有效成分初探[D]. 沈阳：辽宁中医药大学， 2008.

[27] 吴冬呜， 唐燕， 韩艺，等. 大鼠心肌缺血再灌注后不同时间点心脏及肝脏中HIF1、VEGF的表达[J]. 南京医科大学学报：自然科学版， 2012（8）：1047.

[28] Purushothaman J， Suryakumar G， Shukla D， et al. Modulation of hypoxiainduced pulmonary vascular leakage in rats by seabuckthorn （Hippophae rhamnoides L.）.[J]. Evid Based Complement Alternat Med： eCAM， 2011， 2011（5）： 574524.

[29] Tetsuji M， Yoshito O， Atsushi K， et al. Protective role of gap junctions in preconditioning against myocardial infarction[J]. Ajp Heart Circulat Physiol， 2004， 286（1）：214.

[30] Kim Y J， Sang G S， Choi K， et al. Recovery effect of onion peel extract against H2O2induced inhibition of gapjunctional intercellular communication is mediated through quercetin[J]. J Food Sci， 2014， 79（5）：H1011.

[31] Dongeun L， Bongjik S， Haengjeon H， et al. Quercetin， the active phenolic component in kiwifruit， prevents hydrogen peroxideinduced inhibition of gapjunction intercellular communication[J]. Bri J Nutr， 2010， 104（2）：164.

[責任编辑 张宁宁]