忍冬叶活性成分周期变化及其代谢关系研究

刘伟　杨帆　刘峰　周冰谦　耿岩玲　李圣波　郭兰萍　王晓

[摘要] 该文通过对忍冬叶初生及次生代谢过程进行研究，探讨不同发育阶段忍冬叶代谢规律。在每月下旬采收金银花上部5～8片完全展开叶，采用HPLC测定相关代谢指标。结果表明，忍冬叶含水量在3月份最高，达到78.59%，12月份最低，为60.83%；总糖量在冬季最高，1月份达到最高275.8 mg·g-1，其他时间明显降低；忍冬叶中的绿原酸、新绿原酸、木犀草苷和咖啡酸的含量变化基本一致，四者的含量均在3月达到最高，分别为42.79，2.01，7.13，0.16 mg·g-1。忍冬叶的初生代谢产物和次生代谢产物含量在3—5月达到较高水平，与有效成分含量相关的因素主要有钾、镁、磷、门冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。

[关键词] 忍冬叶； 活性成分； 代谢关系

Research on periodical changes and metabolism relations of

active components in Lonicera japonica leaves

LIU Wei1， YANG Fan1， LIU Feng1， ZHOU Bingqian1， GENG Yanling1，

LI Shengbo3， GUO Lanping2， WANG Xiao1*

（1. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology， Shandong Analysis and

Test Center， Jinan 250014， China；

2.National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing 100700， China；

3. Shandong Yate Ecological Technology Co.， Ltd.， Linyi 276017， China）

[Abstract] The study is aimed to explore the metabolism rule of Lonicera japonica by investigating the primary and secondary metabolism process in different growth periods. HPLC and other methods were used to measure metabolism indexes of leaves collected in last ten days of every month. The results suggested that the maximum （78.59%） and minimum （60.83%） of water content were found in March and December. The content of total sugar reached a high level from December to February and the maximum （275.8 mg·g-1） appeared in October， while it reduced significantly at other time. The change of chlorogenic acid， neochlorogenic acid， galuteolin， caffeic acid were basically consistent and the highest content of them synchronously appeared （42.79， 2.01， 7.13， 0.16 mg·g-1） in March. The content of primary and secondary metabolite in L. japonica leaves reached a high level from March to May， and the main related elements with effective components were K， Mg， P， aspartate， threonine， proline， valine， cysteine， isoleucine and phenylalanine.

[Key words] Lonicera japonica leaves； active components； metabolism relations

金银花Lonicera japonica为忍冬科忍冬属常绿或半常绿缠绕藤本植物，是临床常用的中药材之一[1]。主产山东、河南等省，具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆等功能[25]。《本草纲目》曰：“茎、叶及花，功用皆同”[67]。临床研究表明，用忍冬叶鲜品泡茶，对于急性肠炎有很好的治疗效果，可在3 d治疗期限内获得临床治愈[8]。忍冬叶片因产量较高，绿原酸、黄酮等多酚类物质含量丰富，抑菌、抗氧化等药理活性较好，在许多中药、中成药及饮料中广泛使用[912]。张宁的研究结果显示，忍冬叶的粗提物具有良好的抗菌、抗氧化等活性[1315]。但在不同的生长阶段，忍冬叶具有不同的生理作用，其中的活性成分也存在季节性的变化，本文通过研究忍冬叶不同生育期的初生及次生代谢产物的变化情况，为忍冬叶的充分合理利用提供有利的资料。

1 材料

1.1 试药

忍冬叶取自山东省分析测试中心植物园，取样时间为每月的27日，選择生长正常的金银花植株与粗细长短基本一致的枝条，从其上部第5片叶开始，取完全展开的4～6片叶，约100 g。其中，4月至10月所取样品是生长期同一部位叶片，11月至次年3月所取样品为越冬期叶片。实验样本均为5株忍冬的叶混合样本。

1.2 对照品

绿原酸（本实验室自制，纯度≥98%）；新绿原酸、隐绿原酸、3，5二咖啡酰奎宁酸、3，4二咖啡酰奎宁酸、4，5二咖啡酰奎宁酸、咖啡酸、槲皮素、木犀草苷（批号分别为MUST11112202，MUST11112203，MUST11061601，MUST11083102，MUST11081803，MUST12042403，MUST12020101，MUST10122401，纯度≥98%，购自成都曼思特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 生物量的统计

采样后立即测定金银花叶的百叶鲜重，之后杀青烘干，称重，計算含水量。

2.2 初生代谢产物含量的测定

金银花叶中总糖和蛋白质含量均用分光光度法测定。称取0.3 g叶片于比色瓶中，加入20 mL 90 ℃蒸馏水，在90 ℃水浴中加热30 min，稍冷后过滤到50 mL量瓶中，滤渣重复提取1次，过滤到原量瓶中，反复漂洗，定容至50 mL，转移到大离心管中，冷却后放入4 ℃保存。

2.2.1 总糖含量的测定 将样品提取液稀释50倍后取2 mL于试管中，加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯，再加入5 mL的浓硫酸，振荡，沸水浴10 min，冷却后在620 nm处测量吸光度。

标准曲线的制定：分别量取100 mg·L-1的葡萄糖母液0，0.4，0.6，0.8，1，1.5，2.0 mL，加水至2 mL，再加入相应的蒽酮乙酸乙酯和浓硫酸，振荡，沸水浴10 min，于620 nm处测量吸光度，制定标准曲线。

2.2.2 蛋白质含量的测定 取0.5 mL的样品提取液，加入0.95 mL的蒸馏水，再加入4 mL的考马斯亮蓝，反应5 min，测量595 nm处的吸光度。

标准曲线的制定：分别取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 100 mg·L-1的牛血清蛋白BSA至试管中，加入蒸馏水至1 mL，再加入4 mL的考马斯亮蓝，反应5 min，于595 nm处测量吸光度，制定标准曲线。

2.2.3 叶绿素、叶绿素a、叶绿素b含量的测定 称取0.5 g新鲜叶片放入研钵中，加纯丙酮5 mL，少许CaCO3和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5 mL，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20 mL。取上述提取液1 mL，加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663，645 nm处的吸光度A，既可计算出叶绿素a的含量（ρa）、叶绿素b的含量（ρb）和总叶绿素的含量（ρT）：ρa （mg·L-1）=12.7A663-2.69A645，ρb （mg·L-1）=22.9A645-4.68A663，ρT （mg·L-1）=8.02A663+20.21A645。

2.2.4 氨基酸含量的测定 准确称取200 mg粉碎后样品，放入水解管，加入6 mol·L-1的HCl 15 mL，真空封管后置于110 ℃恒温干燥箱水解22 h，过滤后定容至50 mL，取1 mL滤液在40 ℃条件下减压蒸干，用1 mL pH 2.2的缓冲液溶解，使用氨基酸分析仪测定所得溶液的氨基酸含量。

2.2.5 营养元素含量的测定 将采集的金银花叶烘干粉碎，准确称取样品0.2 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入消解剂硝酸5 mL，密封过夜；次日补加1 mL 30%的H2O2，于微波消解炉中应用压力控制程序（压力0.4，0.8，1.2，1.5，1.8 MPa，每一个压力梯度消解4 min），进行消解。样品消解完毕，放置通风橱中冷却，消解液呈无色透明。将消解液转移至50 mL量瓶中，用去离子水稀释至刻度待测。按相同处理方法，同时做平行空白实验。采用火焰原子吸收法对消解样品进行测定分析。样品重复测定3份，取平均值。

2.3 有效成分含量的测定

2.3.1 供试品溶液的制备 称取忍冬叶0.5 g，加50 mL 70%乙醇，超声提取1 h，过滤后为供试样品。

2.3.2 对照品溶液的制备 参考药典2015年版绿原酸的测定方法。称取绿原酸3.5 mg，甲醇溶解后定容至25 mL；称取3，5二咖啡酰奎宁酸1.4 mg，甲醇溶解定容至10 mL；称取咖啡酸1.1 mg、3，4二咖啡酰奎宁酸1.1 mg、4，5二咖啡酰奎宁酸1.1 mg、隐绿原酸1.4 mg、新绿原酸1.2 mg、槲皮素1.6 mg、木犀草苷2.2 mg分别甲醇溶解定容至10 mL，分别取以上溶液0.5，2，2，1，1，0.5，1 mL混合后定容至10 mL。金银花活性成分对照品的HPLC图，见图1。

采用HPLC分别测定绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、木犀草苷、咖啡酸、3，4二咖啡酰奎宁酸、4，5二咖啡酰奎宁酸、3，5二咖啡酰奎宁酸以及槲皮素的含量。色谱条件：安捷伦1120高效液相色谱仪系统（紫外检测器）；色谱柱为InertsilODSRP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）0.1%乙酸缓冲液（B），梯度洗脱，0～15 min，10%～20% A；15～30 min，20% A；30～40 min，20%～0% A；流速1.0 mL·min-1；检测波长327 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。

3 结果

3.1 忍冬叶生物量及初生代谢产物含量的变化

3.1.1 忍冬叶生物量、总糖及蛋白质含量的变化 百叶鲜重在5月分达到最高，为33.78 g，以后到7月逐渐降低，10月又达到1个峰值，为18.90 g。叶片含水量在3月达到最高，为78.59%，12月最低，为60.83%。蛋白质含量在1年中波动不明显。总糖含量在冬季的12，1，2月最高，1月达到最高275.8 mg·g-1，8月达到最低的108.24 mg·g-1，见表1。

3.1.2 忍冬叶光合生理指标的变化 忍冬叶的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素三者的含量在1年中的变化趋势一致，4月至7月含量较高，8月降至最低，到11月达到全年最高，其余月份之间整体差异不大；叶绿素、叶绿素a和叶绿素b最高分别为3.41，2.41，1.00 g·hm-2，都出现在11月；最低分别为0.98，0.79，0.19 g·hm-2，都出现在8月，见表2。

3.1.3 忍冬叶中氨基酸含量 忍冬叶的氨基酸在不同月份的含量存在差异，其中在3，4月和8，9月氨基酸含量较高，12，1，2月含量较低。苏氨酸最高含量与其他月份相差较大，是其他月份的2～5倍；蛋氨酸含量较其他氨基酸偏少，且含量高的月份为1，12月；胱氨酸含量较少的月份为5，6月，而门冬氨酸和赖氨酸在3月含量最少，见表3。

3.1.4 忍冬叶中营养元素含量 忍冬叶在不同生育期的营养元素含量不同，其中，主要营养元素磷和钾在3月份含量最高，质量分数分别为6 297，24 760 mg·kg-1，1月含量最低；微量元素铁和锰变化规律基本一致，在1月达到最高的733.5，153.3 mg·kg-1，7月含量最低；钙、镁和锌的变化趋势基本一致，均在2月含量较高，钙和锌在7月含量最低，镁在4月达到最低；铜的量在各月之间差异不大，9月达到最高的12.79 mg·kg-1，5月含量最低，质量分数为7.883 mg·kg-1；铁、钾、镁、锰、磷和锌的含量从10月到来年1月之间差异不明显，见表4。

3.2 忍冬叶次生代谢产物含量的变化

忍冬叶中的绿原酸、新绿原酸、木犀草苷和咖啡酸的含量变化基本一致，四者的含量均在3月达到最高，质量分数分别为42.79，2.01，7.13，0.16 mg·g-1；咖啡酸含量整体较低，除3月含量最高外，其余月份间基本无差异；绿原酸、新绿原酸和木犀草苷含量均在10月至来年2月左右差异不明显，新绿原酸与木犀草苷在5—7月无明显差异，其余月份间有明显差异，绿原酸一年中各月间差异较大。3，4二咖啡酰奎宁酸在一年中的含量变化规律不明显，3月含量最高，质量分数为2.6 mg·g-1；3，5二咖啡酰奎宁酸含量在前5个月变化较大，5月达到最高，质量分数1.03 mg·g-1，6—9月及12月至来年1月差异不大。槲皮素5月的含量最高，质量分数为0.22 mg·g-1，4，5二咖啡酰奎宁酸在10月达到最高，隐绿原酸在12月达到最高，二者质量分数为别为8.44，0.70 mg·g-1，见表5。忍冬叶有效成分随时间变化的回归方程，X表示时间，Y表示某种有效成分的含量，见表6。

3.3 忍冬叶中有效成分与营养元素、氨基酸的相关性分析

为了探究初生代谢产物与次生代谢产物之间的关系，本文对有效成分与营养元素、氨基酸之间的相关性进行了分析，见表7。元素钾和镁的含量均与木犀草苷、隐绿原酸、咖啡酸和3，4二咖啡酰奎宁酸四者有极显著的相关性，铜、锰和锌的含量与隐绿原酸有着极显著的相关性，钙与隐绿原酸和3，4二咖啡酰奎宁酸有极显著的相关性，而磷与绿原酸、木犀草苷、隐绿原酸和咖啡酸有极显著的相关性。有效成分与氨基酸的相关性分析表明，与有效成分含量呈现相关性的氨基酸主要集中在门冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，其中隐绿原酸与多种氨基酸有相关性，见表8。结果表明，与有效成分含量相关的因素主要为钾、镁、磷、门冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。

4 讨论

叶片是植物赖以生存的重要器官，其所含的叶绿素浓度与植物C同化速率密切相关[1618]，随着植物的生长，光合作用所积累的养分逐渐增加以满足自身生长所需要。本研究表明，在4月至7月，忍冬叶片的叶绿素含量随着光照增强而逐渐提高，而在8月份过高的光强使光合速率降低从而导致了叶绿素含量的降低，至11月叶绿素积累达到全年最高。忍冬叶中的多糖含量在7月以后开始增加，银杏叶中粗多糖的含量从7月开始逐渐增加[1920]，至来年1月达到最高，说明忍冬在上半年的光合作用主要为自身的营养生长以及5—6月生殖生长做准备，而之后营养的贮存为防御低温做准备。

王玲娜等的研究结果表明，日照时数、降雨量、相对湿度对忍冬叶有效成分含量影响较大[21]，绿原酸、木犀草苷、新绿原酸和咖啡酸等主要的有效成分在影响因子变化较大的月份有明显差异，而在气候变化不大的月份差异不明显。潘学标，杨文杰，甄占萱等通过研究棉叶、大豆和桑叶的氨基酸含量变化，提出氨基酸含量在生長速率高的结籽时期前含量较高，且与土壤、气候条件等有关[2224]，这些研究结果为本研究提供了参考。本研究中氨基酸含量在气候

较适宜的3，4月和8，9月较高，而在进入12月后含量较低，与前人研究结果基本一致。安贵阳的研究论文表明，多年生植物的营养元素可在秋冬贮藏，来年春夏季再利用[25]，本文忍冬叶中营养元素含量均在秋冬季含量较高，在进入生长季节后减少，结果与操国兴等的研究结论一致[26]。

有效成分与营养元素、氨基酸的相关性分析结果表明，主要元素钾、磷与多种有效成分呈正相关，其他营养元素均与有效成分有一定的正负相关性，其中除铁之外的营养元素与隐绿原酸均有极显著的相关性；与氨基酸存在相关性的有效成分主要集中在绿原酸、木犀草苷、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸中，其中隐绿原酸与多种氨基酸有相关性，门冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸是主要的与有效成分呈现相关性的氨基酸。这些结果说明部分有效成分的合成代谢很可能与一些营养元素和氨基酸的合成代谢相关，这些因素之间的平衡影响金银花的正常生长和物质积累，也影响着药材的质量和功效。同时，这也为通过改进金银花种植技术从而提高金银花药材质量提供了新的思路，具有一定的参考价值。此外，不同月份研究材料虽然是枝条相同的节位叶片，但时间存在生长旺盛期和越冬期2个阶段，其中的差异对研究结果也可能有一些影响。

忍冬叶初生及次生代谢产物含量的测定为忍冬叶的充分合理利用提供了依据，研究结果在药材采摘时间的确定及药材质量的保持方面有重要的参考价值。

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[责任编辑 吕冬梅]