云南切梢小蠹气味结合蛋白的分子对接

汪宇　孙浩　朱家颖　赵宁　杨斌

摘要：为研究云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）气味结合蛋白（odorantbindingproteins，OBPs）参与其嗅觉识别过程的机理，基于气味结合蛋白、绿叶挥发性物质的三维结构，采用分子对接方法对云南切梢小蠹OBP与3个绿叶挥发性物质可能的结合方式和结合能力进行模拟，结果表明，（E）-2-己烯醇较其他2个小分子而言更容易与云南切梢小蠹OBP结合，形成稳定的氢键。（E）-2-己烯醇与TyunOBP2结合能最低，更容易与TyunOBP2结合，TyunOBP2与小分子物质的结合，可能通过占有该蛋白与寄主气味结合的空间或者通过改变TyunOBP2三维结构，导致TyunOBP2难以识别寄主松树散发的气味。

关键词：气味结合蛋白；分子对接；三维结构；云南切梢小蠹；嗅觉识别；挥发性物质

中图分类号：5；433.5 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0132-03

以计算机为工具，通过理论模拟来指导辅助新型干扰剂分子的设计，可以避免研发干扰剂的盲目性并缩短干扰剂开发周期。例如，受体的三维结构通常用于解释配体和受体的相互作用机制、生物化学反应过程、分子生物学数据以及设计合理的新型抑制剂等。蛋白质一小分子的分子对接是在已知的三维结构下，观察它们之间是否可以结合并预测复合物的结合模式，把配体小分子放在受体活性位点区间，然后按照几何互补、能量互补以及化学环境互补原则来评价配体与受体之间的关系，寻找两者之间的最佳结合模式。不少植食性昆虫都通过嗅觉识别来感受植物释放的挥发性物质。参与嗅觉最重要的蛋白质包括气味结合蛋白（OBP）、化学感受蛋白（csP）、嗅觉受体（OR）、味觉受体（GR）。气味物质与昆虫气味结合蛋白（OBP）结合是云南切梢小蠹（Tomicusyunnanensis）识别气味物质的基础，也是引发昆虫生理反应、行为反应的首要条件。云南切梢小蠹是我国西南地区云南松的重要害虫，专化性较强。自然条件下，云南切梢小蠹以云南松为寄主，搜寻寄主过程中，不可避免会遇上各类非寄主植物。研究表明，非寄主阔叶树种植物散发的绿叶气味物质能干扰小蠹虫识别寄主植物的能力，成为搜寻寄主的障碍。本研究选用已经克隆获得的云南切梢小蠹气味结合蛋白TyunOBP2为对象，将r11yunOBP2与绿叶挥发性物质进行分子对接，获得其复合物结构模型，通过配体与受体之间相互作用能和结构分析给出气味结合蛋白与绿叶挥发性物质的具体结合方式，阐明其干扰机制，旨在为利用非寄主植物的次生代谢产物调控云南切梢小蠹提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

云南切梢小蠹TyunOBP2基因序列来源于GenBank（登录号：YN-2E01NAXM0001_B03.seq）。所用同源模建的结构与配体小分子的晶体数据都由分子绘图GaussView软件生成优化。

1.2方法

AutoDock是半柔性配体整体分子自动对接程序，允许小分子构象发生变化。进行配体取向及构象搜索时，采用模拟退火、遗传算法来寻找最优结合取向和构象，用半经验自由能计算方法来评价受体、配体之间的匹配情况。采用绿叶挥发性物质：（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇，（z）一3一己烯醇与模建气味蛋白进行对接，讨论其与受体的相互作用。

应用Autodocktool对蛋白质及小分子结构进行编辑，并转换成pdbqt格式，应用Autodocktool进行刚性对接，将GridBox大小设置为60点×60点×60点，格点间距0.0375nm，即空间大小为2.25nm×2.25nm×2.25nm。将此晶格的中心位于预测得到的蛋白质活性中心附近，运用Lamarckian遗传算法LGA，将能量搜索与遗传算法相结合，以半经验势能函数作为自由能打分函数，对小分子构象及位置进行全局搜索，利用评分网格以及对接参数（Population为150，Maximun_num_evals设置为2500000）进行分子对接，并进行评分，计算小分子与生物大分子的结合强度（结合自由能）。应用均方根偏差（RMSD，表示预测构象对实际构象的偏差）对对接结果进行评价分析。

2.结果与分析

2.1结合自由能

在Autodock4进行循环搜寻对接构象后，以能量绝对值打分较高的前提下，选取均方根偏差较小的构象进行研究分析，从对接计算得到的聚类构象以及（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）-3-己烯醇对接的结合能对比结果可以看出，3个受体中对接的残基不同直接导致配体在受体中的构象不同（图1），受体中的氧原子与（E）-2-己烯醇的羧基氢形成的氢键能量和表1中的相互作用势能要低于另外2个小分子结合的势能，表明气味结合蛋白分子对（E）-2-己烯醇具有更高的亲和力。

2.2结合模式

从图2可以看出，云南切梢小蠹OBP活性位点位于蛋白质表面上的凹槽中，周围分布OBP的重要功能残基。在多种作用力的参与下，化合物（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）一3一己烯醇牢固地结合在活性位点。从口袋结合模式看，与其他2个小分子相比，（E）-2-己烯醇较深入地进入了OBP的活性口袋，这是由于（E）-2-己烯醇较容易形成稳定的氢键，以利于其深入口袋（图3、图4）。

3.结论与讨论

（E）-2-己烯醛、（E）-2-己烯醇、（z）-3-己烯醇是非寄主植物阔叶树的主要挥发性物质，是6个碳的绿叶挥发性物质。当这3种绿叶挥发性物质与寄主植物的气味相混合时，会对小蠹虫选择产生干扰。本研究结果表明，（E）-2-己烯醇较其他2个小分子而言，更容易与云南切梢小蠹OBP结合，形成稳定的氢键。从化学结构来看，（E）-2-己烯醇中的糖取代基、羧基较多，更容易形成氢键；（E）-2-己烯醛、（z）-3-己烯醇中的羧基相对较少，形成的氢键较少，导致3种绿叶挥发性物质的结合能各不相同。王大伟等认为，48h后，经（E）-2-己烯醇处理后留在松梢外的云南切梢小蠹数量最多，（E）-2-己烯醇处理对云南切梢小蠹影响最大。本研究结果表明，（E）-2-己烯醇与BunOBP2结合能最低，更容易与r11yunOBP2结合，TyunOBP2与小分子物质的结合，可能通过占有该蛋白与寄主气味结合的空间或者通过改变TyunOBP2三维结构，导致TyunOBP2难以识别寄主松树散发的气味。从对接的结合模式图来看，小分子与受体分子表面的作用也是决定其活性的重要因素之一，（E）-2-己烯醇和OBP之间可能存在疏水作用力、范德华力，导致其结合能较低；因此，加强小分子的疏水性或者形成氢键能力均有可能增强化合物的抑制活性。本研究选用云南切梢小蠹1个已知的气味结合蛋白作为对象，计算并模拟TyunOBP2与3个绿叶气味物质的分子对接，计算结果与前人试验结果一致，说明利用同源建模和分子对接方法模拟气味物质与气味结合蛋白结合有一定的可靠性。实际上，昆虫在进化过程中发展多个气味结合蛋白识别多种气味物质，云南切梢小蠹也有多个气味结合蛋白，是否还存在比TyunOBP2更容易与小分子绿叶气味物质结合的其他气味结合蛋白还需进一步研究。