戊糖片球菌发酵对满族酸茶中植酸质量浓度的影响

臧 敏, 王 璐, 叶 淑 红, 范 子 仪

( 大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

满族酸茶,又称为“甜酸茶”,是我国五常、双城等地一种有着200多年历史的传统发酵谷物食品[1]。酸茶的传统做法是选用小米、黄豆等谷物为原料,室温下经自然发酵而成[2],制成的酸茶酸甜适宜,具有消食化积、止渴生津等功效[3]。

谷物经酶解和发酵等加工方法制成发酵谷物饮料,不仅可以增加营养价值、增强生物活性,还可以起到降低抗营养因子的作用[4]。植酸是一种含磷的化合物,由肌醇逐步磷酸化产生,是谷物中存在的主要抗营养因子之一。目前降低谷物中植酸质量浓度的有效方法之一是采用具有植酸降解能力的微生物进行发酵[5]。乳酸菌在发酵过程中产生特殊酶系和有机酸等多种代谢产物,能够赋予食品特殊的风味,达到抑制杂菌生长、延长产品的储藏期等目的[6]。戊糖片球菌是一种潜在的益生菌菌株,具有抗癌、抗炎、抗氧化、解毒、降脂等功效[7]。

本研究以小米、玉米和黄豆为原料,采用从传统工艺制作的满族酸茶中筛选的戊糖片球菌作为发酵剂制备满族酸茶饮品,并采用单因素试验及正交试验优化乳酸菌发酵工艺,以确定最佳的发酵工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米、玉米、大豆,市售;戊糖片球菌(P.pentosaceus)LS-2,筛选自自然发酵的满族酸茶,保藏于大连工业大学食品学院;中温α-淀粉酶(酶活4 000 U/g)、糖化酶(酶活50 000 U/g),食品级,河南万邦实业有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 工艺流程

选用干净饱满且无杂质、新鲜的原料,清洗烘干后粉碎过筛。将原料按配比(小米、玉米、大豆质量比3∶1∶1)加适量水于料理机中打浆,打浆后进行糊化处理。按每克添加20 U中温α-淀粉酶对原料进行液化处理,在75 ℃下恒温水浴处理50 min,完成后沸水浴灭酶10 min。冷却后用无水柠檬酸调节pH,按每克添加150 U糖化酶进行糖化处理,在60 ℃下恒温水浴处理2.5 h,完成后沸水浴灭酶10 min。酶解结束后的料液均质5 min,分装进行巴氏灭菌。将戊糖片球菌LS-2接入MRS肉汤培养基中活化,以8 000 r/min离心5 min,弃去培养基,用无菌水重复洗涤2～3次制成发酵剂,接入灭菌完成的料液中。接种后的料液置于37 ℃恒温摇床以130 r/min进行发酵。发酵完成的料液过滤后进行灌装,经65 ℃下杀菌30 min后冷却至室温,即可得到成品满族酸茶。

1.2.2 乳酸菌生长曲线及产酸能力的测定

挑取少量固体培养基保存的戊糖片球菌于MRS肉汤培养基中进行活化处理。取活化好的种子液调节OD600为(1.00±0.05),以2%接种量接种于MRS肉汤培养基,于37 ℃下培养48 h,每隔4 h测定菌液的OD600和pH,绘制戊糖片球菌的生长曲线和产酸能力曲线。

1.2.3 发酵工艺优化单因素试验

对料液进行发酵工艺研究,分析料液比(1∶5,1∶6,1∶7,1∶8,1∶9(g/mL))、装液量(30%,40%,50%,60%,70%)、接种量(2.0%,2.5%,3.0%,3.5%,4.0%)、发酵温度(33,35,37,39,41 ℃)、发酵时间(10,12,14,16,18 h)等单因素对满族酸茶的植酸质量浓度和感官评分的影响。

1.2.4 发酵工艺正交试验

根据单因素试验优化的结果,选取料液比(A)、装液量(B)、发酵温度(C)和发酵时间(D)4个因素,采用正交表L9(34)进行正交优化试验,考察各个因素对满族酸茶感官评分的影响,确定最佳发酵工艺,因素水平见表1。

表1 正交优化试验因素水平表Tab.1 Orthogonal optimization test factor level table

1.2.5 植酸质量浓度测定

1.2.5.1 标准曲线的绘制

准确称取植酸钠标准品1.735 g,用超纯水溶解并稀释至0.1 mg/mL,分别准确吸取植酸钠标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于7支玻璃试管中,加入超纯水补足至3 mL,再分别加入三氯化铁-磺基水杨酸反应溶液1 mL,混匀后于500 nm处测定吸光度,绘制出标准曲线[8]。

1.2.5.2 植酸质量浓度的测定

取5 mL样品加入40 mL提取溶液(1.2% HCl-10% Na2SO4),经160 r/min振荡提取2 h,8 000 r/min离心15 min,上清液定容至50 mL。取2 mL加入15% TCA溶液2 mL,混匀后置于4 ℃下处理2 h,离心取全部上清液加超纯水定容至25 mL。取3 mL待测液加入1 mL三氯化铁-磺基水杨酸反应溶液后,在500 nm处测定吸光度。根据吸光度以及准曲线方程计算得出植酸的质量,并计算植酸在样品中的质量分数。

1.2.6 理化指标测定

利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质[9]。利用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖[10]。根据GB 12456—2021酸碱滴定法测定总酸。根据GB/T 12143—2008折光计法测定可溶性固形物。根据福林酚比色法测定总酚[11]。

1.2.7 微生物指标测定

分别根据GB 4789.2—2016、GB 4789.3—2016和GB 29921—2013检测大肠菌群、菌落总数和致病菌。

1.2.8 感官评分方法

选定10人(5位女生,5位男生),评分方法采用100分制,分别从色泽、气味、口感和组织状态4个方面分别进行感官评分,评分标准见表2。

表2 酸茶感官评价表Tab.2 The sensory evaluation form of sour tea

1.3 数据处理

采用Excel 2013及SPSS 22.0对数据进行分析处理,采用Origin Pro 8.5进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 戊糖片球菌生长曲线和产酸特性

从图1可知,戊糖片球菌菌株的生长曲线呈现典型的“S”形,0～4 h时,菌液的OD600增长缓慢,因为刚接入培养基时菌株处于生长延滞期;4～12 h时OD600迅速增长,表明菌株进入对数生长期;12～28 h时菌液OD600增长缓慢,表明菌株繁殖速度变慢,开始进入生长稳定期。同时,发酵液pH的变化情况与菌株的生长情况相符合,延滞期pH变化很小,生长对数期pH下降较快,是主要的产酸时期,28 h后发酵液的pH趋于平缓。

图1 戊糖片球菌LS-2的生长曲线和产酸曲线Fig.1 Growth curve and acid production curve of Pediococcus pentosaceus LS-2

2.2 料液比对植酸质量浓度和感官评分的影响

如图2所示,随着料液比的减小,酸茶中的植酸质量浓度呈现降低的趋势。感官评分随料液比减小先增加后降低,在料液比为1∶8时感官评分达到最高。酸茶成品的稀稠程度对口感的影响很大,料液比大时发酵液稠度过大,适口性差,而水量加入过多则会导致发酵液过度稀释,风味欠缺,甚至出现明显的分层现象。综合考量,确定最佳料液比为1∶8(g/mL)。

图2 料液比对植酸质量浓度和感官评分的影响Fig.2 The effect of material-to-liquid ratio on the phytic acid contents and sensory scores

2.3 装液量对植酸质量浓度和感官评分的影响

由图3可知,植酸质量浓度随装液量的增加先减小后增大,在装液量50%时植酸质量浓度出现最低值,此时的成品酸度适中,感官评分最高。当装液量大于50%时,植酸质量浓度增大,感官评分降低,可能是因为装液量过多,溶氧系数降低,不能满足菌体生长的需求。综合考量,选择最佳装液量为50%。

图3 装液量对植酸质量浓度和感官评分的影响Fig.3 The influence of the liquid volume on the phytic acid contents and sensory scores

2.4 接种量对植酸质量浓度和感官评分的影响

如图4所示,随着接种量的不断增加,植酸质量浓度先降低后升高,感官评分先升高后降低。接种量为3.0%时,酸茶的植酸质量浓度最低,感官评分最高。当接种量大于3.0%时,营养物质被过快消耗,此时成品的酸味逐渐加重,感官评分随之降低。接种量大于3.0%时,接种量过高可能会引起体系过度酸化,影响植酸酶的活性。综合考量,选择最佳接种量为3.0%。

图4 接种量对植酸质量浓度和感官评分的影响Fig.4 The influence of the amount of inoculation on the phytic acid contents and sensory scores

2.5 发酵温度对植酸质量浓度和感官评分的影响

如图5所示,当发酵温度为37 ℃时,产品口感酸甜适宜,感官评分最高;但当温度超过37 ℃,会抑制乳酸菌生长,影响菌株的产酸能力,此时的感官评分随发酵温度的升高而逐渐降低。当温度到39 ℃时,植酸质量浓度最低,与37 ℃时产品的植酸质量浓度相差不大,但此时感官评分较低。综合考量,最佳发酵温度为37 ℃。

图5 发酵温度对植酸质量浓度和感官评分的影响Fig.5 The effect of fermentation temperature on the phytic acid contents and sensory scores

2.6 发酵时间对植酸质量浓度和感官评分的影响

如图6所示,随着发酵时间的延长,植酸质量浓度出现先降低后趋于平稳状态,感官评分则是先升高后降低,发酵到12 h时,感官评分出现最大值。当发酵14 h后,植酸的质量浓度趋于平稳而无明显变化,但是发酵过度会使产品的感官评分出现下降。综合考量,最佳发酵时间为12 h。

图6 发酵时间对植酸质量浓度和感官评分的影响Fig.6 The effect of fermentation time on the phytic acid contents and sensory scores

2.7 正交试验结果与分析

从表3可见,料液比、装液量、发酵温度和发酵时间对酸茶感官评分影响的主次顺序为C、A、D、B。利用极差分析法得到乳酸菌发酵酸茶的最优发酵组合为A3B1C2D2,即料液比1∶8(g/mL)、装液量40%、发酵温度37 ℃、发酵时间12 h,各因素的主次顺序为A、D、B、C。由表3可得到最优发酵组合为A3B2C3D2,即料液比1∶8(g/mL),装液量50%,发酵温度37 ℃,发酵时间14 h。

表3 正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of orthogonal experiment

从表3可以看出,发酵时间是最重要的影响因素,但对植酸质量浓度影响较小,从节约时间成本的角度考虑,选择最优发酵时间为12 h。在装液量为50%时,植酸质量浓度最低,且B1和B2感官评分差异不大,因此选择最优装液量为50%。综合评判,酸茶最优的发酵工艺条件组合为A3B2C2D2。

对最优工艺再次进行验证,制得酸茶感官评分为83.7分,植酸质量浓度为0.85 mg/mL。

2.8 产品质量评价

感官评价：经乳酸菌发酵制得的酸茶呈淡黄色,组织状态良好,口感细腻、酸甜适中,拥有浓郁的谷物香气和乳酸发酵产生的香气。

理化指标：在最优发酵条件下得到的满族酸茶蛋白质质量浓度为31.7 g/L,还原糖质量浓度为24.5 g/L,总酸质量浓度为2.7 g/L,总酚质量浓度为1.62 mg/mL,可溶性固形物质量分数5.5%。

微生物指标：菌落总数≤100 CFU/mL;大肠菌群≤30 MPN/L;致病菌未检出。

3 结 论

以小米、大豆和玉米为主要原料,通过乳酸菌发酵研究制作满族酸茶的最佳发酵工艺。通过单因素试验和正交分析法优化了满族酸茶乳酸菌发酵的工艺条件,确定最佳工艺参数：固液比1∶8(g/mL),乳酸菌接种量3.0%,装液量50%,37 ℃发酵12 h。在最优发酵工艺条件下,酸茶的感官评分为83.7分,植酸质量浓度0.85 mg/mL,颜色为淡黄色,富含营养物质,拥有谷物和乳酸的特殊香气,酸度适宜,口感细腻。