枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件优化

黄璠 蔡俊

在我国，饲用酶制剂的开发与利用始于20世纪90年代[1]。多年来，人们发现蛋白酶对动物尤其是幼龄动物有着独特的作用，目前饲料工业中应用的蛋白酶多为酸性蛋白酶，而不同pH值的蛋白酶对饲料作用的影响正成为饲料行业的一个研究热点，已有相关报道，中性蛋白酶作为饲料添加剂有很好的效果[2－4]。但中性蛋白酶的产量低、成本高等因素限制了其大规模应用[5]。本研究以枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件为研究对象，通过单因素试验和正交试验优化了产酶的发酵条件，取得了很好的效果，为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），本实验室保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化钠5 g/l、琼脂 20 g/l、水 1 L，pH 值 7.2～7.4。

种子培养基：液体斜面培养基。

发酵培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氢二钠 4 g/l、硫酸镁 0.2 g/l、水 1 L，pH 值 7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 初始发酵条件

取活化好的斜面菌株，接种一环到一级种子培养基（50/250 ml），37℃、160 r/min培养14 h后，以3%(V/V)的接种量接入发酵培养基（50/250 ml），37℃、160 r/min培养48 h。

1.2.2 蛋白酶活力测定[6]

按国家标准(GB/T23527—2009)，采用 Folin－酚法测定中性蛋白酶活力。

1.2.3 发酵条件优化

1.2.3.1 发酵条件的单因素试验

采用单因素试验，分别考察装液量、转速、培养基初始pH值、发酵周期、接种量和发酵温度对产酶的影响。装液量(250 ml三角瓶中)分别为 30、50、70、90 ml；转速分别取160、180、200和220 r/min；培养基初始pH值分别取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2；发酵周期分别取24、36、48、60、72 和 84 h；接种量分别取 1%、2%、3%、4%、5%；发酵温度分别取33、35、37、39和 41 ℃。

1.2.3.2 发酵条件的正交试验

在上述单因素试验的基础上，选取部分影响较大的因素（装液量、初始pH值、发酵周期），进一步缩小范围进行3因素3水平正交试验，正交试验因子与水平设计见表1。

表1 正交试验因子与水平设计

2 结果与分析

2.1 不同单因素对发酵产中性蛋白酶的影响(见图1～图6)

图1 装液量对产酶的影响

由图1可知，最优装液量为50 ml。此时(即初始条件下)酶活为36.755 ml，由于装液量小，培养基中的营养成分少，不利于产酶，且资源利用率低。装液量大，可能对溶氧有一定的影响，枯草芽孢杆菌是好氧菌，也不利于产酶。

图2 转速对产酶的影响

由图2可知，转速为200 r/min时酶活最大，此时酶活为46.988 U/ml，随着转速的增大，酶活增大，说明转速增大，溶氧增大，有利于产酶；当转速大于200 r/min时酶活降低，可能是转速继续增大，对枯草芽孢杆菌本身有损害，从而使酶活降低。

由图3可知，最优初始pH值为6.7，此时酶活为78.411 U/ml，pH值继续升高，酶活降低，说明弱酸性培养基有利于菌株产酶；由图4可知，最优发酵周期为60 h，此时酶活为86.987 U/ml；由图5可知，最优接种量为4%，此时酶活为109.041 U/ml；由图 6可知，最优发酵温度为37℃，此时酶活为120.067 U/ml，温度过低不利于菌体的生长和代谢产酶，温度过高菌体易衰老而影响其正常的生长和代谢。

图3 初始pH值对产酶的影响

图4 发酵周期对产酶的影响

图5 接种量对产酶的影响

图6 发酵温度对产酶的影响

2.2 部分发酵条件的正交试验研究

由上述单因素试验结果可知，装液量、初始pH值和发酵周期对发酵产酶的影响较大，进一步缩小范围，采用L9（33）正交设计法进行3因素3水平正交试验，正交试验直观分析结果和方差分析结果分别见表 2、表 3。

表2 发酵条件正交试验直观分析结果

表3 方差分析结果

由表2可知，这3种因素对产酶的影响效果不同，其影响程度为：装液量(ml)＞初始pH值＞发酵周期(h)，这3种因素对产酶影响都是显著的，所得的最优组合为 A3B3C2，即装液量 60 ml，初始pH值6.9，发酵周期60 h，恰好与正交表中的方案9一致，在此发酵条件下对产酶最有利，最大酶活为151.319 U/ml。

3 结论

通过发酵条件（装液量、转速、培养基初始pH值、发酵周期、接种量和发酵温度）的单因素试验以及装液量、培养基初始pH值和发酵周期的正交试验，得到了最优发酵条件为装液量 60 ml，转速200 r/min，初始pH值6.9，发酵周期 60 h，接种量4%，发酵温度37℃。由正交试验证明了装液量、培养基初始pH值和发酵周期对产酶影响显著。通过发酵条件的优化，酶活提高了311.7%。

[1]Bedford MR.Exogenous enzymes in monogastric nutrition－their current value and future benefits[J].Animal Feed Science and Technology,2000,86:1－13.

[2]凌宝明,冯定远,左建军.饲用蛋白酶的研究进展[J].饲料工业,2009,30(22):7－10.

[3]陈建明,叶金云,许尧兴,等.饲料中添加中性蛋白酶对青鱼生长、消化及鱼体组成的影响[J].水生生物学报,2009,33(4):726－731.

[4]李艳丽,许少春,许尧兴.中性蛋白酶高产菌株的筛选及产酶酶系分析[J].生物技术,2007,17(1):20－23.

[5]孙晓鸣,王萍,邬向东.产中性蛋白酶芽孢杆菌配伍发酵响应面法研究[J].中国食品学报,2010,10(2):117－124.

[6]中华人民共和国国家技术监管局.GB/T23527－2009ICS67.220.22X69－2009,蛋白酶制剂[S].北京:标准出版社,2009.