离子液体辅助纤维素酶Tma Cel5A降解黄原胶的性能

陈 春 树, 李 宪 臻, 杨 帆

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

降解黄原胶的方法主要有物理法、化学法以及酶法3种[3],酶法相对于其余两种方法具有反应条件温和、选择性相对较好的优点,是理想的多糖降解方法。但是黄原胶高度致密的结构会导致酶解十分困难,所以寻找高效降解黄原胶的方法具有重要的意义。离子液体(ionic liquid,IL)能够通过破坏多糖分子内和分子间的氢键网,使多糖处于无序松散的状态[4]。

除了对多糖底物的高级结构产生影响之外,离子液体对绝大多数的多糖水解酶还存在不同程度的抑制作用甚至会使其完全失活[5]。所以寻找耐受IL的酶对寡糖的制备具有重要的意义。Datta等[6]发现来源于嗜热细菌Thermatogamaritima的纤维素内切酶Cel5A对IL具有较好的耐受性,暴露于15%[C2mim][OCOOH]中15 h后活性几乎没有损失。

本实验将来源于嗜热细菌Thermatogamaritima的纤维素内切酶TmaCel5A导入大肠杆菌中进行表达纯化,使用该酶对IL预处理的黄原胶进行降解,并考察了酶解产物的性质,以期获得高效的黄原胶寡糖的制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

E.coliDH5α,大连宝生物有限公司;E.coliBL21(DE3),大连化学物理研究所赵宗保教授赠予;限制性内切酶PstⅠ、SmaⅠ、DNA Marker,大连宝生物有限公司。

LB液体培养基：胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl 1.0%;LB低盐培养基：胰蛋白胨1.0%,酵母浸粉0.5%,NaCl 0.5%;LB固体培养基：LB液体培养基加入琼脂粉1.5%～2.0%。

DYY-11型电泳仪,北京市六一仪器厂;JY92-IIN超声破碎仪,宁波新芝生物技术有限公司;AKTA蛋白质纯化系统,GE医疗;ICS-5000离子色谱,美国Thermo Fisher Scientific公司;Spectrum two傅立叶变换红外光谱仪,铂金埃尔默仪器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 纤维素内切酶基因Cel5A的全基因合成

实验组的治疗依从性评分为(19.56±1.28)分,参照组的治疗依从性评分为(14.15±1.40)分,实验组患者平均住院(5.55±0.49)天,参照组患者平均住院(9.57±0.94),结果存在统计学差异性,实验组患者的服务态度评分平均是(4.26±0.45)分、健康宣教评分平均是(4.90±0.30)分;参照组患者为(3.09±0.44)分、(2.90±0.30),两组结果对比存在统计学差异性(P<0.05)。

全长951 bp的编码纤维素内切酶TmaCel5A的基因序列由上海生工公司全基因合成并连接到pET28a载体上,得到pET28a-Cel5A。全基因合成产物由上海生工生物技术有限公司进行测序。

1.2.2 纤维素内切酶TmaCel5A的异源表达及纯化

将鉴定正确的pET-Cel5A质粒电转至BL21(DE3)感受态细胞中,选取单个菌落进行培养并提取质粒,使用PstⅠ、SmaⅠ进行双酶切验证,正确的转化子进行表达。挑取单菌落接种于10 mL含有Kan抗生素的LB培养基中制备BL21(DE3)-Cel5A种子液,将种子液以体积比1∶50接种于200 mL含Kan的LLB培养基,37 ℃、200 r/min摇床培养12 h,添加终浓度为0.5 mmol/L IPTG,在30 ℃、200 r/min条件下诱导20 h以生产目标蛋白。菌液于8 000g离心5 min收集沉淀,并用40 mL Binding buffer重悬,使用超声破碎菌体细胞。纤维素内切酶TmaCel5A利用Ni-NTA填料进行纯化,操作流程按照文献[7]进行。纯化后的蛋白使用5倍Loading buffer制备成蛋白样品,SDS-PAGE进行鉴定,使用Bradford法[8]对纯化后的蛋白进行浓度测定。

1.2.3 黄原胶的GPC分析

色谱柱选用PL aquagel-OH 60、PL aquagel-OH MIXED-M和PL aquagel-OH 30,将3种柱子串联使用。柱温40 ℃,流动相0.1 mol/L NaNO3,体积流量0.8 mL/min。采用示差折光检测,将普鲁兰糖作为标准品[9]。

1.2.4 纤维素内切酶TmaCel5A离子液体耐受性测定

使用PHABH法[10]测定酶活,选用3种类型的IL实验使用低浓度的IL对黄原胶进行预处理,同时参照文献[6],每种IL设定1%和5%两个体积分数,具体操作步骤：100 μL酶液与100 μL 2 mg/mL黄原胶底物充分混合,45 ℃条件下水浴30 min,取200 μL PHABH混合液加入反应体系,煮沸10 min,测量OD405。将煮沸失活的蛋白设为空白对照,每组设定3个平行。酶活力单位定义：每分钟生成1 μmol/L还原糖所需的酶量为1 U。

1.2.5 纤维素内切酶TmaCel5A的最适温度及最适pH的测定

将酶与黄原胶反应体系放于不同温度下反应30 min后,立刻测定酶活。以测定最高的酶活力为100%,计算各温度下的相对酶活力。温度设定为30、40、50、60、70、80 ℃。

用不同pH缓冲液稀释至一定浓度,于45 ℃与黄原胶底物反应30 min后进行酶活力测定。以测定最高的酶活力为100%,计算各pH下的相对酶活力。缓冲液以及pH设定：柠檬酸-柠檬酸钠(pH 3.0,3.5,4.0);乙酸-乙酸钠(pH 4.0,4.5,5.0);Na2HPO4-NaH2PO4(pH 5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0),以pH 4.0和5.0为过渡点。

1.2.6 纤维素内切酶TmaCel5A降解黄原胶产物的离子色谱分析

使用ICS-5000系统(Dionex,Thermo Fisher,USA),色谱柱为阴离子交换保护柱Carbo Pac PA100(Guard,50 mm×4 mm,Dionex)和阴离子交换分析柱Carbo Pac PA100 (Analytical,250 mm×4 mm,Dionex)。选用AgCl检测,器柱温设定30 ℃,体积流量1 mL/min,黄原胶寡糖样品由流动相200 mmol/L NaOH和1 mol/L NaCOOH进行梯度洗脱,梯度洗脱初始条件为50% H2O和50% 200 mmol/L NaOH,随着时间的推移NaCOOH体积分数逐渐增大,最终流动相为50% 1 mol/L NaCOOH和50% 200 mmol/L NaOH,在20 Hz波频处进行信号收集,确定产物中黄原胶寡糖组分。

1.2.7 纤维素内切酶TmaCel5A降解黄原胶产物的红外光谱分析

使用FT-IR检测黄原胶寡糖吸收峰的变化情况。通过KBr压片法制备样品,置于压片机中转动摇杆至8～9 MPa,制成透明试样薄片,测定波数为450～4 000 cm-1,分辨率为0.8 cm-1。检测结果的最高峰应处于在5～25 T。

2 结果与讨论

2.1 纤维素内切酶编码基因Cel5A的全基因合成结果鉴定

如图1、图2所示,pET28a-Cel5A基因大小为6 382 bp,经双酶切后有2条条带,大小分别为1 513和4 869 bp。将酶切验证正确的质粒进行测序,结果表明pET28a-Cel5A质粒合成正确。将构建好的质粒pET-Cel5A转化至E.coliBL21(DE3)感受态当中,于37 ℃条件下过夜培养。

1～9,基因条带;M,DNA Marker

1～9,酶切后的重组质粒条带;M,DNA Marker

2.2 纤维素内切酶Tma Cel5A的异源表达及纯化

图3表明,TmaCel5A成功地在大肠杆菌中高水平可溶性表达,经过纯化后所获得的TmaCel5A条带纯度较高,目的蛋白TmaCel5A大小约为37 ku。

1,纯化后的Tma Cel5A蛋白;M,蛋白Marker;2,pET28a空载蛋白

2.3 纤维素内切酶Tma Cel5A最适温度和最适pH

如图4所示,纤维素内切酶TmaCel5A在反应温度35～45 ℃时酶活力再逐渐提升,当温度为45 ℃时酶活力达到最大值,之后酶活力会随着温度的上升而下降,同时在60和75 ℃时存在酶活力上升的情况,说明TmaCel5A对高温具有一定的耐受性,但是其酶活力远低于45 ℃时酶活力。综上所述,纤维素内切酶TmaCel5A的最适温度为45 ℃。同时对TmaCel5A的最适pH进行测定,如图5所示。结果表明,TmaCel5A在pH 5.0时酶活力达到最大,说明纤维素内切酶TmaCel5A的最适pH为5.0。

图4 纤维素内切酶Tma Cel5A的最适温度Fig.4 The optimum temperature of cellulose endonuclease Tma Cel5A

图5 纤维素内切酶Tma Cel5A的最适pHFig.5 The optimum pH of cellulose endonuclease Tma Cel5A

2.4 纤维素内切酶Tma Cel5A对IL的耐受性

如图6所示加入1% [Bmim]Cl(Ⅰ)、5% [Bmim]Cl(Ⅱ)、1% [Emim]OCOOH(Ⅲ)、5% [Bmin]OCOOH(Ⅳ)、1% [Emim]DEP(Ⅴ)、5% [Emim]DEP(Ⅵ),纤维素内切酶TmaCel5A的酶活都有一定提升,说明纤维素内切酶TmaCel5A对于离子液体具有一定程度的耐受性,可以通过加入一定量的离子液体辅助酶降解黄原胶生产更多的寡糖。实验选用1% [Emim]DEP辅助纤维素内切酶TmaCel5A降解黄原胶制备寡糖,并对该方法进行初步验证。

图6 纤维素内切酶Tma Cel5A对不同离子液体的耐受性结果Fig.6 Tolerance of cellulose endonuclease Tma Cel5A to different ionic liquids

2.5 纤维素内切酶Tma Cel5A水解黄原胶的性质

2.5.1 纤维素内切酶TmaCel5A降解黄原胶离子色谱检测

对使用1% [Emim]DEP辅助酶法获取的产物进行分析,结果如图7所示。结果显示,5～10 min处出现一个明显的寡糖峰,约为二糖结构单元;在15～20 min出现两个寡糖峰,可能为四糖或五糖结构单元[11]。使用离子液体预处理的黄原胶酶解产物在种类与未加入离子液体的酶解产物没有太大差别,但酶解产物量有一定提升,与酶活结果相对应,说明加入一定量的离子液体有助于酶降解黄原胶生成更多的寡糖。

图7 纤维素内切酶Tma Cel5A降解黄原胶的离子色谱Fig.7 Ions chromatography results of xanthan degraded by cellulose endonuclease Tma Cel5A

2.5.2 纤维素内切酶TmaCel5A降解黄原胶红外光谱检测

图8 纤维素内切酶Tma Cel5A降解黄原胶红外光谱Fig.8 Infrared spectra results of xanthan degraded by cellulose endonuclease Tma Cel5A

3 结 论

对来自Thermatogamaritima的纤维素内切酶编码基因Cel5A进行了密码子优化和全基因合成,并将其在大肠杆菌中进行了异源表达和纯化,获得较高纯度的TmaCel5A蛋白。优化了纯化的TmaCel5A酶解条件,确定其最适作用温度为45 ℃,最适pH为5.0。通过凝胶色谱检测得知超声对于黄原胶打开其致密结构有一定的帮助,以超声后的黄原胶作为底物进行酶活测定,结果表明,TmaCel5A对离子液体[Bmim]Cl、[Emim]OCOOH、[Emim]DEP均有一定的耐受性。对生成的黄原胶寡糖使用离子色谱以及红外光谱酶活对其性质进行研究,结果表明加入一定量离子液体对寡糖的生成有帮助。