机械灌注在劈离式肝移植中的应用研究进展

孙江波，潘胜辉，陈维佳，徐 剑

（海南医学院第二附属医院器官移植科，海南 海口 570105）

1 劈离式肝移植特点及发展情况

1.1 劈离式肝移植（SLT）的发展历程

Pichlmayr 等［1］于1989 年 开 创 了 劈 离 式 肝 移 植的先河，最开始的SLT 供给一个成人和一个儿童受者治疗其终末期肝病，且供肝的劈离为获取之后在体外进行，发展初期，多数移植中心认为SLT 术后会导致扩大右半肝部分移植疗效不佳而发展缓慢。Goss 等［2］开始采用在体劈离的方法使SLT 的术后并发症（如胆道并发症、血管并发症等）明显减少，同时缩短了患者的CIT（约1.5 h），并改善了横断面的胆漏和出血情况。2000 年，Gundlach 等［3］开始进行左右半肝劈离，将SLT 的应用范围进一步的扩大，但这种情况下的供肝容易出现移植物供者重量比（graft recipient weight ratio，GRWR）无法满足受者需求的问题。SLT 在劈离和移植等手术技术方面目前已经非常成熟，而劈离获得的两个边缘供肝的保存成为限制其发展的主要因素。

1.2 劈离式肝移植的现状

目前，以左外叶为界限劈离的SLT 在远期生存率方面和全肝移植相同，但其他如早期生存率（1 年生存率）、再次肝移植发生率、胆道并发症、血管并发症及S4 段胆漏等方面的研究显示SLT 与其他全肝移植可能存在差异［4］。而左右半肝类型的SLT中，由于其GRWR 更小且横断面损伤更加严重，其综合预后更差，仅1/3 的研究显示半肝移植后生存率与全肝移植无显著差异［5］。尽管在体劈离改善了SLT 的结局，例如：（1）冷缺血时间缩短；（2）更好的识别胆管和血管，使得劈离的横断面更加精准；（3）复温时损伤减轻（由于减少了修肝及体外劈离的时间）；（4）能观察到各段血供的情况，有利于血管的合理分配［6］；但目前整个过程仍然存较多问题，主要涉及劈离后肝脏的损伤和修复。

1.3 劈离式肝移植目前存在的问题

SLT 多数情况下需要较大的移植中心（可以做儿童肝移植的中心）和较小的移植中心（主要行成人肝移植的中心）合作进行，大多数SLT 分配时需要进行长距离的运输，这增加了CIT 延长相关的并发症，使得本来较小的GRWR 实际生理可用的肝脏体积更小。Ishii 等［7］的研究认为SLT 术后的ALT、AST 等水平较高，不适合进行静态低温保存（static cold storage，SCS），否则会增加早期移植物功能障碍（early allograft dysfunction， EAD）和严重的缺血损伤的发生率，Angelico 等［8］研究发现SCS 会影响移植肝中的微血栓形成，这对劈离的横截面中S4 段末梢血管影响尤其明显，影响其肝脏功能，也可造成胆管周围微血管损伤，进一步导致胆管上皮细胞损伤和弥漫性胆管缺血狭窄的发生。此外横断面的损伤在SLT 中是不可避免的，但长期的SCS 增加横断面的氧化应激及免疫反应，也更容易造成S4 段的缺血坏死或者胆漏的发生［9］。Lau 等［10］研究认为上述因素在高危受者和儿童受者中影响更大。机械灌注能够维持供肝微循环并进行治疗性干预的特点可能会使上述问题得到解决。

2 机械灌注与劈离式肝移植优势互补

1968 年Starzl 开展的第一例肝移植便是进行了机械灌注保存［11］，可以说机械灌注伴随着肝移植产生而产生，但是由于当时的技术条件并不完善，机械灌注并没有发挥其理想中的优势。后期随着UW液、HTK 液的出现，机械灌注的地位曾经一度降低［12］，直到2009 年，美国哥伦比亚大学医学中心的Guarrera 及其同事首次开展机械灌注保存人类肝脏的前瞻性临床试验将机械灌注的应用再次“唤醒”［13］，使得大家对机械灌注再次充满期待。近些年随着技术的发展和边缘供体的逐渐增多，尤其是近10 年来各项机械灌注的临床研究剧增［14-16］，机械灌注再次成了器官移植领域热门的话题。目前在机械灌注在各种类型的边缘性供肝如DCD、老年供肝、脂肪肝等肝移植的临床研究开展较多，且大多取得良好的效果，而机械灌注在SLT 方面的应用目前还有较大开发潜力和尚未解决的难题［17］。

3 机械灌注的分类

目前的研究将机器灌注维护肝脏的情况按照温度分为3 类，从低温（4 ℃～10 ℃）、亚低温（20 ℃～25 ℃）到常温（35 ℃～37 ℃）［18］。目前的划分的温度是较为宽泛的概念，并没有严格的界限值。三种不同类型下的机械灌注存在很大区别，不仅仅是在温度上的不同，其涉及的分子生物学机制、适宜使用的范围以及灌注液的类型也有很大的差异。各种类型的机械灌注有其特有的优势，并没有明确的证据认为在何种情况下灌注效果最好，目前已经有很多研究开始将不同类型的机械灌注进行联合应用。

3.1 低温机械灌注（hypothermic oxygenated machine perfusion ， HOMP）与劈离式肝移植

3.1.1 低温机械灌注的特点及作用机制 低温机械灌注的使用和开发最早，目前相关的研究也最为详细，鉴于其安全性高、技术设备要求简单、技术成本低、方便携带的特点［19］，目前认为低温机械灌注最可能在SLT 临床使用中大范围的推广，尤其适合用于劈离供肝的远距离的运输。SLT 的横断面通过损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）释放增加损伤的各类因子，在早期（4～6 h）缺血再灌注起关键作用，损伤性应激可转变为潜在的细胞致死性的先天性免疫应答［20］。而Ishii 等［7］的 研 究 显 示HOMP 能 够 显 著 减 少DAMPs（如TNF-α、干扰素-γ、白细胞介素-1β 和白细胞介素-10）水平。低温机械灌注能够和充氧设备结合，在合成充足的ATP 的过程中氧离子的传递仅仅造成轻微氧化应激［21］，并能够降低活性氧和DAMPs 水平［22］。HOMP 的独特优势是即使机械系统发生故障，也仅仅是转为普通的SCS，并不会造成极其严重后果［23］，这是其他类型的机械灌注系统所无法比拟的。上述研究为低温机械灌注在SLT中的应用提供了理论基础。

3.1.2 低温机械灌注在劈离式肝移植临床方面的应用 目前低温机械灌注在临床方面的应用结果显示其能从多方面改善SLT 预后不良。van Rijn 等［24］的一项多中心随机对照试验（78 例HOMP，78 例SCS）显示HOMP 组中6%的受者和SCS 组中18%的患者发生非吻合性胆道狭窄，12% 的HOMP 和27% 的SCS 受者发生再灌注后综合征，HOMP 组发生早期同种异体移植物功能障碍的发生率较SCS组少（26%∶40%）。与对照组相比，机器灌注后非吻合性胆道狭窄的累积治疗次数减少了近1/4。这说明低温机械灌注在维持胆道的微血管灌注、减少移植物功能障碍方面起到至关重要的作用。Spada等［25］采用双低温氧合机械灌注（dual hypothermic oxygenated machine perfusion，D-HOMP）对SLT 的两部分肝脏进行灌注保存，其中左外叶保存11 h，扩大右半肝保存14 h，尽管缺血时间显著延长，但未发生再灌注后综合征或PNF 移植肝原发性无功能，移植前监测的最大乳酸盐峰值<5 mmol/L，在置入受者体内后两受者的各项指标均快速恢复。组织学上，两部分移植物在SLT 后7 d 仅显示轻度缺血再灌注损伤。低温双通道氧合机械灌注（dual hypothermic oxygenated machine perfusion， D-HOMP）是一种新兴技术，相比较于单纯的门静脉HOMP 灌注D-HOMP 增加了动脉灌注，通过恢复线粒体功能，减轻再灌注时氧自由基的产生，减少炎性反应，减少了动脉血栓形成和胆管缺血坏死的发生率，使缺血再灌注最小化。Thorne 等［26］的研究显示将劈离后的两个供肝采用D-HOPE 进行灌注保存，左外叶和扩大右半肝的总冷缺血时间分别为 205 min 和 468 min，移植术后左外叶的AST 和ALT 的峰值分别为172 IU/L 和107 IU/L，扩大右半肝的AST 和ALT峰值分别为 839 IU/L 和 502 IU/L，这显著小于同种类型的肝移植的肝脏损伤水平。这说明D-HOPE可以提高SLT 的肝脏利用率，减少横断面的损伤，促进肝功能的恢复。

3.2 常温机械灌注（normothermic perfusion，NMP）与劈离式肝移植

3.2.1 常温机械灌注的特点 NMP 的理论基础是肝脏器官在体外保持生理温度的同时维持其基本代谢功能。其灌注设备在向肝脏提供灌注液的方式上与低温机械灌注有所不同，为移植物提供了代谢所需的氧气，使得移植肝保存时间更长。目前NMP 要求离体灌注溶液必须使用氧载体，所有已发表的临床试验都主要以红细胞为氧转运体。世界首项常温灌注肝移植的相关研究最早由Ravikumar等［27］于2016 年在美国实施，20 例患者在 NMP 后接受了肝移植。中位 NMP 时间和范围为 9.3 （3.5～18.5） h，中位冷缺血时间和范围为 8.9 （4.2～11.4）h，NMP 组30 天 移 植 物 存 活 率 与SCS 组 相 似（NMP100%vsSCS97.5%，P=1.00），NMP 组AST 的 峰 值 417（84～4 681）U/L 较 对 照 组902（218～8 786）U/L 相比显著降低（P=0.03）。这项研究证明了非运输过程中或到或运达受者移植中心后进行机械灌注下劈离的安全性和有效性。

3.2.2 常温机械灌注在劈离式肝移植方面的特殊优势 常温机械灌注近10 年来的发展迅速，常温机械灌注过程中进行的劈离、治疗性干预、保存时间更长（甚至达到几天）可能会使得SLT 发生革命性变化。目前已经有多中心随机对照的临床研究利用便携式常温机械灌注降低移植后发生EAD 和胆道并发症的发生率，其中使用便携式常温机械灌注（NMP）的样本量为153 例，而低温冷保存（ICS）147例，而NMP 尤其是在EAD 方面改善最为明显（18%vs31%），而在缺血再灌注方面的情况也有较好改善（例如：有更少的中度至重度肝小叶炎症6%vs13%），最重要的是DCD 的捐献比例也有了显著的提升，其中NMP 组中的55 例DCD 中有28 人最后得到使用，而SCS 组中的51 例DCD 供肝中仅有13 例最后成功使用，这充分说明了常温机械灌注对临床的显著作用［14］。国内目前常温机械灌注的研究也有较大进展，其中Guo 等［28］的研究显示常温机械灌注的无缺血肝移植组中（样本量为38∶130）EAD 的发生率显著降低，同时发现受者的AST 水平显著下降，而总胆红素的水平在7 d 内也显著低于普通组。NMP 在保存时需要较高的氧气供应，而且需要专用的透析系统来清除废物，因此该系统极其的昂贵和复杂，且当出现故障时后果严重［15］。这是目前NMP 暂无法在SLT 中广泛推广的主要原因，但随着技术的成熟，NMP 可能才是非运输状态下最高效的SLT 器官保存办法。

3.2.3 常温机械灌注与低温机械灌注的特点比较常温机械灌注与低温机械灌注的不同是，其可以保存的时间更长，甚至可以超过24 h［29］。尽管目前NMP 在SLT 中的应用未能像HOMP 一样得到广泛推广，但其在横断面胆漏和渗出的处理、治疗性干预（例如为RNA 基因沉默、细胞调节疗法、人肝干细胞的胞外囊泡、血管扩张剂和脱脂疗法、阿片类激动剂等多种方法提供了途径）的优势是其他类型的保存方法无法比拟的［30］。但NMP 技术操作复杂，在整个过程中可能都需要进行调整和监测，在肝脏运输过程中可能并不适用，而如果在SLT 的两个受者都在同一个中心则可以使用常温灌注，或者在低温运输后与常温机械灌注联合应用能够起到很好的效果。常温机械灌注的另一个问题是从常温到低温的两次反复的缺血再灌注，尽管这个过程时间很短，但对肝脏的影响却至关重要，不过有研究认为这个问题可能通过亚低温状况下的受控氧合复温（controlled oxygenated rewarming， COR）灌注类型解决［31］。

3.3 亚低温机械灌注（sub-nomorthermic machine perfusion， SNMP）与劈离式肝移植

目前关于亚低温的相关研究相对较少，与HMP 相比， SNMP 比HMP 消耗更少的氧气，能够更快地恢复供肝的功能，降低内皮细胞损伤的发生率，降低门静脉阻力，增加胆汁产量［32］，对于左右半肝劈离（获得的较小的GRWR 的半肝）是很好的选择，扩大了供体池。SNMP 相较于NMP 在维持肝脏代谢活动方面有一定的优势，Yoshida 等［33］的研究发现亚低温条件下的机械灌注的乳酸代谢更为活跃，且氨代谢要强于HOMP。当NMP 和HOMP相互转换时，血管到周围肝组织完全灌注之间存在明显的延迟，虽然时间很短，但延迟会将灌注不足的区域直接暴露在室温下，对移植肝胆管细胞影响极大。近年来，SNMP 中的受控氧合复温（COR）这一新概念的提出使得SNMP 的研究有了较大进展［31］，同时也对各种类型机械灌注的联合应用提供了 新 方 案。Hoyer 等［34］研 究 显 示COR 能 够 降 低DCD 肝移植术后的血清转氨酶的峰值，且术后1年、3 年、5 年生存率分别为84.5%、82.0%、75.8%。研究发现COR 能够显著降低肝酶产生、TNF-α 相关的基因表达活动、自由基介导的脂质过氧化和再灌注时门脉血管灌注阻力，弥补HOMP 和NMP 转换过程中存在的问题。

4 机械灌注对劈离式肝移植应用标准的影响

机械灌注在脂肪肝、DCD 供肝、老年供肝方面的显著疗效使SLT 的供体范围进一步扩大。机械灌注在脂肪肝方面有很好的逆转效果［35］，这些能够使得SLT 的标准（脂肪肝程度小于10%）进一步的放宽，这可能使得SLT 的总量提高20% 以上。Boteon 等［36］采用特殊的药物组合灌注液使得有脂肪肝的供肝在6 h 的机械灌注过程中甘油三酯减少38%，组织中大泡型脂肪变性减轻了40%。此外，随着老龄化的提高，目前多个国家如意大利、阿根廷等国家已经将SLT 的年龄限制不断放宽，机械灌注可以使得更多的老年供体得到使用，将SLT 的标准提高到55 岁以上［37］。有研究显示机械灌注能够避免DCD 肝脏缺血再灌注损伤在保存过程中进一步加重，且肝细胞和胆管内皮细胞损伤明显减少。Dutkowski 等［38］的研究显示采用低温机械灌注保存DCD 供肝能够使得移植后ALT 显著降低，胆道并发症减少，移植后的早期生存率（1 年生存率）减小，与脑死亡相比达到了同样的效果，即使热缺血时间（对缺血再灌注影响最大）延长也术后的DCD 的5年移植物存活率也能够获得94%的疗效，而未治疗的DCD 移 植 物 为78%（P=0.024）。Dondossola等［39］的研究采用双低温氧合灌注（D-HOPE）用于DCD 研究后显示效果更好的6 个月、1 年的生存率（均为100%），而对照组为80%和67%，研究还发现其灌注后的ATP 情况明显升高，这说明机械灌注能够极大的改善DCD 的结局。总之，机械灌注能够改善减轻供体的炎症反应、内质网应激、线粒体损伤和细胞凋亡等变化，从而改善胆管内皮细胞和肝细胞的能量代谢。

5 机械灌注对劈离式肝移植的治疗性干预

在未来，机械灌注在维护供肝中可能起到更重要的作用，甚至可以起到治疗的作用。目前已经有相关研究开始应用组织型纤溶酶原激活物（tissue—type plasminogen activator，t-PA）来治疗劈离引起的肝动脉血栓，以改善胆管周围血供并减少胆管损伤［40］。此外，目前很多相关研究是采用劈离的办法获得同质的两个半肝，从而减少机械灌注研究中的异质性［41］，反向的促进了机械灌注的发展，这是其他类型的边缘供肝所无法达到的。早期研究表明，小干扰RNA（short interfering RNA， siRNA）在转录后基因调控肝脏的缺血再灌注方面有独特优势，但这种方法在体内或静态冷保存下有很大的限制，机械灌注的优势可以将si-RNA 溶解入灌注液中为基因调控提供更好的途径，同时对全身其他部位组织和器官的影响很小，改善缺血再灌注的效果更好［42］。类似的例子还有很多，例如通过Treg 细胞疗法减少移植物抗宿主病［43］，利用人间充质基质细胞改善微循环的缺氧抑制巨噬细胞产生细胞因子［44］，利用前列腺素E1 改善DCD 的缺血再灌注损伤［45］，应用抗生素、米拉韦森对肝脏进行机械灌注可以减少原发病复发和感染［30］，总之，机械灌注不仅仅是一种器官保存的办法，而且能够为SLT 的不足提供干预性治疗的“桥梁”。

6 总结

SLT 在保证成人肝移植的同时将额外获得的供肝用于儿童肝移植，显著的增加了供体的来源，而SLT 的早期预后不佳和劈离相关的术后并发症阻碍了其发展。机械灌注对SLT 产生了革命性的影响，目前低温机械灌注在SLT 中的应用已经开始进入临床，常温机械灌注的特殊优势可能使SLT 发生翻天覆地的变化，亚低温机械灌注使得各类机械灌注联合使用成为可能，联合机械灌注能使SLT 在脂肪肝、年龄、DCD 供肝方面的标准得到扩展，在未来甚至可能通过机械灌注对SLT 进行治疗性干预，成为其他干预措施与SLT 的桥梁。

作者贡献度说明：

孙江波：收集相关文献并撰写论文；徐剑：负责文章构思和审核；潘胜辉，陈维佳：文章润色，格式校正。

所有作者声明不存在利益冲突关系。