解整合素金属蛋白酶12 在膀胱癌中表达及意义

张晓林，汪 盛

（蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科，安徽 蚌埠 233000）

膀胱癌是常见的癌症之一，随着人口增长及老龄化，膀胱癌发病率将呈上升趋势［1］。2018 年，膀胱癌跃居于全球恶性肿瘤第12 位［2］。大约70%的膀胱癌在诊断时被归类为非肌层浸润性膀胱癌（nonmuscle-invasive bladder cancer， NMIBC），而其余约30%被归类为肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer， MIBC），NMIBC 中高级别原位癌有侵 袭 膀 胱 壁 肌 肉 组 织 的 趋 势，从 而 成 为MIBC［3，4］。在生物学和临床水平上，NMIBCs 是一种异质性癌症，具有易复发特点［5］。虽然目前针对早期膀胱癌治疗可以取得较好疗效，但进展为中晚期膀胱癌后，目前尚无有效治疗措施。相比NMIBC，MIBC预后要差很多，因此，迫切需要降低膀胱癌进展几率及改善中晚期膀胱癌预后的措施。如今，探索膀胱癌发病机制是肿瘤进展和治疗研究的热点之一［6］。如果可以研究出针对膀胱癌有效的免疫制剂或分子靶向药物将为膀胱癌患者带来福音。此外，发掘可用于诊断或预后标志物，研究人员目前所关注的一个重要方向是明晰膀胱癌的发生和发展机制。

ADAM 是一种蛋白质家族，含有崩解素和金属蛋白酶结构域，广泛参与生物过程的调控，包括细胞迁移、黏附、分化和增殖等［7，8］。ADAM12 是家族成员之一，基因位于10q26.3，具有典型的ADAM 家族结构序列，包括金属蛋白酶、崩解素、富含半胱氨酸和表皮生长因子样结构域，可能与水解蛋白、细胞黏附以及细胞内信号传导等功能有关［9-11］。已有多项研究表明ADAM12 在多种癌症中高表达并促进恶行肿瘤进展，例如乳腺癌［12］、结直肠癌［10］、肝癌［13］、胰腺癌［14］等；其中，相关文献报道表明ADAM12 通过调控肿瘤免疫浸润及上皮间质转化（EMT）促进胃癌进展［15］。尽管ADAM12 在膀胱癌中研究已有报道，但其作用机制尚未被明确阐明，其与肿瘤免疫细胞关系也未见报道［18］。

因此，利用生物信息学方法结合体外实验研究来分析ADAM12在膀胱癌中的表达情况，同时也探讨它与临床病理特征以及免疫细胞浸润之间的关系，从而深入研究其可能对膀胱癌进展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

采用上海细胞库购买的正常人膀胱细胞SVHUC-1 以及膀胱癌细胞系UMUC3、5637、J82 作为实验材料。膀胱癌细胞系T24 由蚌埠医学院第一附属医院郭园园课题组惠赠。

主要试剂和仪器：MEM、DMEM 及1640 培养基购自武汉普诺赛公司，牛胎儿血清（FBS）购自浙江天航生物，胰酶购自美国Gbico 公司，小干扰siRNA 及质粒购自上海吉满生物公司，nanotrans 购自合肥佰欧晶公司，引物购自安徽通用生物公司，Marker、Trizol、逆转录试剂盒MonScriptTMRTlll All-in-One Mix with dsDNase 及实时荧光定量PCR 试剂盒MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 均购自武汉莫纳生物公司，蛋白酶磷酸酶抑制剂及BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物公司，一抗及二抗分别购自武汉Proteintech 生物公司和北京Bioss 生物公司。多功能酶标仪（型号：1510）购自美国赛默飞公司；实时荧光定量PCR 仪（型号：7500）购自美国Bio-Rad 公司。光学显微镜（型号：4J09628）购自日本Olympus 公司。

1.2 标本来源

蚌埠医学院第一附属医院病理科采集了30 例2021 年度膀胱癌患者的手术切除标本蜡块。纳入标准：（1）全部为全膀胱切除患者；（2）所有患者术前均未进行放、化疗；（3）已经我院病理检查确诊；排除标准：（1）经尿道局部电切患者；（2）术前已经过治疗患者；（3）合并其他重大疾病患者。本实验计划经蚌埠医学院伦理委员会同意。

1.3 数据下载和处理

从TCGA 数据库官方网站下载膀胱癌转录组FPKM 数据，总共有412 个膀胱癌组织样本和19 个正常膀胱组织样本。利用R.4.0.3 等软件对对下载的基因表达数据进行归一化处理，然后使用log2转化，以便进行后续分析。同时，应用自动操作将膀胱癌患者的临床病理特征信息进行下载和提取，并筛选出仅保留临床信息完整的数据用于后续分析。

1.4 数据库及生物信息学分析

TCGA 数据库分析ADAM12 在肿瘤与正常组织中的表达，并根据其表达水平进行预后分析。利用 公 共 在 线GEPIA 数 据 库（http：//gepia.cancerpku.cn）对基因相关性分析。使用GSEA4.0.3 软件进行基因富集分析。 利用仙桃学术数据库（https：//www.xiantao.love）对基因ADAM12进行泛癌分析，并探索其与EMT 相关标志物之间的相关性。利用CIBERSORT 方法计算膀胱癌样本中22 个免疫细胞浸润比例，使用P<0.05 作为过滤标准，过滤结果使用柱状图显示；同时提取并分析ADAM12基因与免疫细胞浸润之间相关性，并通过散点图展示。

1.5 ADAM12 表达与临床病理特征相关性分析

根据膀胱癌患者中ADAM12表达水平的中位数，将膀胱癌患者分为高表达组和低表达组。使用SPSS Statistics 25.0 统计软件分析ADAM12表达与年龄、性别、T阶段、N阶段、M阶段、Grade分级、Stage分期等之间的关系。我通过对膀胱癌患者的生存数据和ADAM12的表达量进行单因素和多因素cox回归分析，研究了ADAM12在膀胱癌患者中的预后价值。这些数据来自于TCGA-BLCA数据库。

1.6 免疫组化检测

使用DAB 法对肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化染色，经烘烤后，脱蜡、水合、抗原再生等过程，在加入3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后，样品接着加入了一抗（兔抗，稀释比例为1∶200），然后在4 ℃条件下孵育过夜（共计12 h），接着使用通用二抗（抗兔，稀释比例为1∶2 000），在37 ℃条件下孵育30 min。随后，使用DAB 光镜显色，并对样品进行脱水、封片，最后在显微镜下观察并统计结果。蛋白表达强度的计算方法为：在100 倍和400 倍高倍放大镜下分别随机选择3 个不相邻的视野进行观察，根据细胞质中呈现棕色或棕黄色颗粒的数量来评估染色强度（0：阴性；1∶弱阳性；2：中等阳性；3：强阳性）；计算阳性染色细胞占细胞总数的百分比，并计算分数分（0 分：0；1 分：1%～10%；2 分：11%～50%；3 分：51%～80%；4 分：81%～100%）。每个切片的染色强度评分是通过将二者的得分相乘得出的。得分范围从0 到1 分，表示阴性，用“-”符号表示；从2 到4 分表示弱阳性，用“+”符号表示；从5 到8 分表示中等阳性，用“++”符号表示；从9 到12 分表示较强阳性，用“+++”符号表示。

1.7 细胞培养及转染

细胞在37 ℃、5% CO2中培养，是含有1%双抗及10%胎牛血清的MEM 培养基。将UMUC3 和J82 细胞分别接种到一个有6 个孔的培养板中。在细胞融合率达到50%～60%时，根据nanotrans 说明书将小干扰或质粒转入细胞，6 h 后更换正常完全培养基。继续培养24 h 后用于后续实验。转染分组：siNCvs.siADAM12 或NCvs.oe-ADAM12。

1.8 qRT-PCR 检测

收集UMUC3 细胞，使用Trizol 试剂提取各组细胞总RNA。根据RNA 的定量结果，使用逆转录试剂盒MonScriptTMRTlll All-in-One Mix with dsDNase 将总RNA 逆转录成cDNA（反应条件：37 ℃ 2 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min）。以cDNA 为模板，利用实时PCR 试剂盒MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 说明书配置反应体系，完成qRT-PCR 反应（反应条件：95 ℃ 30 秒，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40 个循 环）。采 用2-ΔΔCT法 分 析ADAM12 表 达 水 平。ADAM12 F：5' - CGAGGGGTGAGCTTATGGAAC-3'；R：5'-GCTTTCCCGTTGTAGTCGAATA-3'。GAPDH F：5'-GAGAAGTATGACAACAGCCTCAA - 3'；R：5' - GCCATCACGCCACAGTTT-3'。

1.9 Western Blot 检测

将UMUC3 及J82 细 胞 转 染24 h 后，使 用RIPA提取总蛋白，并使用BCA 试剂盒对蛋白进行定量，将不同样本进行浓度统一化处理。按每孔20～40 μg 总量进行上样，每组设置3 个复孔，上样结束后进行电泳（条件：120 mV 2 h）。将电泳好的PAGE 凝胶进行转膜（条件：400 mA 1 h），在结束后，将PVDF 膜放入5%脱脂奶粉中室温封闭2 h。成功封闭后，使用TBST 清洗膜3 次，然后在4 ℃孵化一抗体过夜。ADAM12、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH 及二抗的稀释浓度分别为 1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000 和1∶5 000。

1.10 CCK-8 检测

将各组UMUC3 细胞铺至96 孔板中，每组5 个复孔，每孔2 000 个细胞、100 μL 完全培养基，待细胞贴壁后，将每个孔中加入10 μL CCK-8 试剂，随后放入培养箱中孵育2 h，接着使用酶标仪检测各个孔在450 nm 波长下的吸光度值（OD 值）。依此类推，在0、24、48 和72 h 连续记录各个孔的数值。最后，通过酶标仪在OD450 波段检测OD 值，并计算细胞的增值率。

1.11 Transwell 检测

迁移实验：先取24 孔板，将转染成功的UMUC3 的各组细胞消化离心，用无血清MEM 重悬细胞并计数，按每孔5×104个铺至小室每个孔都添加了100 μL 无血清培养基，并且小室外部每个孔添加了500 μL 含有20%血清的完全培养基。每组有3 个重复孔，在培养箱中培养24 h。取出小室，予以4% 多聚甲醛固定2 h，室温染色1% 结晶紫15 min，然后拿出小室，用棉签和PBS 清洗小室内部，最后，将放置小室在显微镜下拍照计数（使用160 倍放大率），以便最终计算各组细胞的迁移率。

1.12 划痕实验

将UMUC3 细胞消化离心，加入5 mL 培养基重悬并计数，按每孔2×105细胞数铺至6 孔板，在将细胞培养至密度约60%～70% 左右后，进行转染实验，并分别设立对照组和实验组。在每个孔中细胞密度达到90%以上时，使用10 μL 枪头垂直划痕，并在显微镜下以64 倍放大拍照，记录0 h、24 h 和48 h的划痕面积。

1.13 统计学处理

使用Graphpad prism 8.0 软件和SPSS25.0 统计软件进行统计分析，使用平均±标准差（±s）进行测量，两组间比较采用t检验，使用spearman 进行相关性检验，P<0.05 对差异具有统计意义。

2 结果

2.1 ADAM12 在膀胱癌中表达及预后

基于TCGA 数据库，配对与非配对分析结果表明，膀胱癌组织中ADAM12 表达水平明显高于正常组织（P<0.05，见图1A-B），且高表达与预后呈负相关（P=0.007，见图1C）。qRT-PCR 检测结果显示，ADAM12 在膀胱癌J82 及UMUC3 细胞系中表达高于正常膀胱细胞（t值分别为15.01、19.91，均P<0.05，见图1D）。泛癌分析结果表明ADAM12 在泛癌中普遍高表达，其中膀胱癌组织中的表达量高于正常组织（P<0.05，见图1E）。

2.2 免疫组化检测

免疫组化（IHC）染色图像表明ADAM12 位于细胞质和质膜中。评分结果表明，膀胱癌组织中ADAM12 的表达水平显著高于邻近组织（t=8.308，P<0.05，见图2）。

图2 IHC 检测膀胱癌与邻近组织中ADAM12 表达量Fig 2 ADAM12 expression in bladder cancer and adjacent tissues detected by IHC

2.3 ADAM12 表达与膀胱癌患者临床病理特征相关性分析

基于TCGA 临床数据，ADAM12 在膀胱癌中表达与年龄、Grade 分级、Stage 分期、T 分期和N 分期等有关（P<0.05），而与性别和M 分期无关（P>0.05，见图3）。在单因素COX 回归分析中，年龄、分期、T 分期、N 分期、ADAM12 均可作为膀胱癌的潜在预后因素（P<0.05）；Cox 多因素回归分析结果提示，ADAM12 可作为膀胱癌的独立预后变量（P<0.05）。见表1。

表1 单因素和多因素回归分析ADAM12 在膀胱癌中的作用Tab 1 Univariate and multivariate regression analysis of the role of ADAM12 in bladder cancer

图3 ADAM12 与膀胱癌临床病理特征关系Fig 3 Relationship between ADAM12 and clinicopathological features of bladder cancer

2.4 GESA 富集分析

使用GSEA 鉴定响应ADAM12 高表达而富集的相关基因。在ADAM12 高表达组中，ADAM12与侵袭和转移相关的肿瘤途径、细胞黏附分子、ECM 受体显著相关（P<0.05，见图4A）；另外ADAM12 还参与趋化因子信号通路、肿瘤发生、和癌症相关多种途径（P<0.05，见图4B）。

2.5 敲低ADAM12 抑制膀胱癌细胞生物学行为

敲低UMUC3 细胞ADAM12基因表达，qRTPCR 检测结果显示，相较于NC 组，siADAM12-2 组（简称si2）敲低效率最佳（t=8.676，P<0.05，见图5A）。Western Blot 检测进一步证实干扰效率（见图5B）。对 比NC 组，CCK8 检 测 结 果 显 示，siADAM12-2 组细胞活力降低（t=11.64，P<0.05，见图5C）；Transwell 结果显示，siADAM12-2 组细胞迁移能力显著降低（t=7.852，P<0.05，见图5D）；划痕实验结果显示，siADAM12-2 组细胞愈合能力显著降低（t=8.49，P<0.05，见图5E）。

图5 ADAM12 影响膀胱癌细胞生物学行为Fig 5 ADAM12 affecting the biological behavior of bladder cancer cells

2.6 ADAM12 通过触发EMT 促进膀胱癌细胞迁移

TCGA 数 据 库 分 析 显 示，ADAM12 与EMT 相关标志物E-cadherin 负相关（r=-0.144，P=0.003）、与N-cadherin 正相关（r=0.646，P<0.001）、vimentin正 相 关（r=0.754，P<0.001）、Snail 正 相 关（r=0.605，P<0.001）、MMP2 正 相 关（r=0.784，P<0.001）及MMP9 正相关（r=0.596，P<0.001，见图6A）。Western Blot 检测结果表明，对比NC 组，敲低组E-cadherin 蛋白表达增加，N-cadherin、vimentin蛋白表达降低（见图6B）；过表达则结果相反（见图6C）。

图6 ADAM12 促进膀胱癌细胞上皮间质转化Fig 6 ADAM12 promoting epithelial-mesenchymal transformation in bladder cancer cells

2.7 ADAM12 与膀胱TICS 相关性

CIBERSORT 计算19 个正常样本和412 个肿瘤样本，过滤结果柱状图显示（P<0.05，见图7A）。根据CIBERSORT 方法计算的结果，ADAM12 的表达与M1 巨噬细胞正相关（r=0.19，P=0.01）、M2 巨噬细胞正相关（r=0.46，P<0.000 1）、CD4+记忆静止T 细胞正相关（r=0.16，P=0.03），与树突状细胞负相关（r=-0.4，P<0.000 1）、滤泡辅助T 细胞负相关（r=-0.2，P=0.007 6）、调节性T 细胞呈负相关（r=-0.16，P=0.032，见图7B）。接着相关性分析ADAM12 与免疫检查点关系，结果显示ADAM12 与 免 疫 检 查 点CTLA4（r=0.15，P=0.002 7）、PDCD1（r=0.13，P=0.007 9）和LAG3（r=0.1，P=0.038）表达呈正相关（见图7C）。

3 讨 论

目前，越来越多的研究表明，上皮间质化转化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）在癌症的进展和转移中起着重要作用［16］。同样，EMT 是膀胱癌转移的关键过程。先前研究表明，EMT 是促进NMINC 到MIBC 重要的生物过程［17］。因此，需要积极探索到能够预测膀胱癌预后且能成为调节膀胱癌转移的靶标分子变得尤为重要。

在本研究中，首先利用TCGA 数据库分析表明ADAM12 在膀胱癌中高表达且与不良预后相关，体外细胞实验及免疫组织化学检测进一步证实ADAM12 在膀胱癌中高表达。临床病理特征分析结果表明ADAM12 与不良分期、分级显著相关。多因素cox 回归分析表明，ADAM12 可以作为膀胱癌独立预后因子。既往研究也报道称ADAM12 有希望作为膀胱癌的预后标志物［18］。这些研究结果表明ADAM12 可能作为膀胱癌预后的有力预测因子。

其次，为进一步探索ADAM12 是否影响膀胱癌EMT 发生，首先利用GSEA 富集分析，结果表明其主要与“细胞黏附”、“ECM 受体”和“多种信号通路”相关，说明ADAM12 在肿瘤转移和癌症信号通路活化中具有潜在作用。相关文献报道称ADAM12 参与细胞黏附并可以降解各种细胞外基质（ECM）蛋白，明胶、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白在细胞外基质（ECM）重塑过程中扮演着重要角色，ECM 重 塑 是 肿 瘤 性 疾 病 的 特 征［19，20］。此 外，ADAM12 与基质金属蛋白酶（MMP）密切相关，并通过ECM 的切割和生长因子的释放参与细胞外基质（ECM）的重塑和细胞信号传导［21］。已知ECM 改变与EMT 发生密切相关，而癌症中的EMT 与肿瘤侵袭、迁移相关［22-24］。同样，在本研究结果中，ADAM12 与EMT 相 关 标 志 物E-cadherin 负 相 关，而 与N-cadherin、vimentin、Snail、MMP2 及MMP9 等呈正相关。实验结果表明，当敲低ADAM12 时，E-cadherin 表达增加，N-cadherin 及vimentin 表达降低；当过 表 达ADAM12 时，E-cadherin 表 达 下 降，N-cadherin 及vimentin 表达增加。在细胞实验中，敲低ADAM12 可抑制膀胱癌细胞迁移。所有结果都表明了ADAM12 是膀胱癌细胞中EMT 的重要调节因子。在相关研究报道中，称ADAM12 与EMT 发生密切相关，其通过调控胃癌细胞EMT 促进肿瘤侵袭迁移［25］；在乳腺癌中，甚至将ADAM12 确立为一种新的EMT 标志物［26］。这与本研究结果一致，ADAM12 通过刺激EMT 促进膀胱癌细胞迁移。

最后，进一步探索了ADAM12 是否影响膀胱癌免疫微环境。相关文献表明ADAM12 参与多种肿瘤进展，可能通过免疫浸润影响肿瘤的发生与发展［21，27，28］。在这项研究中，发现了ADAM12 的表达水平与膀胱癌患者体内多种免疫细胞的浸润具有显著的相关性。其中ADAM12 的表达与M2 巨噬细胞有显著的正相关。巨噬细胞是肿瘤转移和免疫抑制的必要因素，巨噬细胞具有M1 和M2 两种表型，从而可以分别促进肿瘤免疫反应或刺激肿瘤发展［29］。肿瘤相关巨噬细胞主要表现为M2 样表型，通过促进肿瘤免疫抑制刺激肿瘤生长［30］。其中，TAM 的M2 极化通过导致巨噬细胞产生生长因子和细胞因子，在调节肿瘤生长、迁移和血管生成中起重要作用［31］。最后，我们进一步分析了ADAM12与免疫检查点的关系，发现其与CTLA4、PDCD1 和LAG3 等表达呈正相关。这些结果表明，ADAM12可能通过调控免疫细胞浸润进而影响膀胱癌进展。

综上，研究证实了ADAM12 在膀胱癌中高表达，与不良预后相关。通过生物信息学及一系列实验研究表明，ADAM12 通过调控EMT 发生从而促进膀胱癌细胞迁移；另外，ADAM12 可能影响肿瘤免疫微环境。但本研究仍有不足之处，我们仅仅是基于数据库数据分析了ADAM12 高表达与患者的不良预后相关，缺乏临床随访数据进一步佐证。另外，未能深入研究ADAM12 影响EMT 及M2 巨噬细胞极化的具体机制，需待未来研究进一步探索。总之，ADAM12 可能作为膀胱癌的不良预后因子和治疗靶点。

作者贡献度说明：

张晓林：完成本文的构思和实验，并对文章数据进行统计学分析；汪盛对本实验进行指导及论文修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。