基于cfDNA 脑脊液液体活检在髓母细胞瘤的研究进展

2023-10-22 01:24符炳彪赵泽宇安思龙陈华帅赵建农
海南医学院学报 2023年18期
关键词:危险度亚型脑脊液

符炳彪,赵泽宇,安思龙,陈华帅,赵建农

(海南医学院,海南 海口 570311)

髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)是胚胎源性中枢神经系统恶性肿瘤,WHO Ⅳ级,常见于儿童,主要发生于第Ⅳ脑室顶上的小脑蚓部,有沿软脑膜转移的倾向[1]。随着分子生物学的深入研究,普遍的共识将MB 分为WNT 激活型、SHH 激活型、Group 3 型 和Group 4 型 四 个 分 子 亚 型,WHO 于2016 年将其更新在MB 的诊断分类中,分子亚型与预后显著相关[2,3]。在2021 年WHO 中枢神经系统肿瘤分类中,已将MB 分子亚型中的Group 3 型和Group 4 型 合 并 为non-WNT/non-SHH 型,在 大 规模甲基化和转录组分析的研究基础下,这3 个主要分子亚型中出现了新的亚型,与MB 的3 个主要分子分型一样,其中一些亚型与临床病理和遗传特征相关,具有重要的诊断、预后价值[4]。目前MB 采用手术、放疗和化疗等的综合治疗方案,术后放化疗是MB 重要的治疗手段,治疗决策往往需要在治疗获益与毒副作用之间权衡,因此,监测治疗反应显得十分重要[5]。MRI 和脑脊液细胞学检查是常用监测治疗反应的方法,但监测的信息具有一定的滞后性,组织活检是疾病诊断的金标准,侵入性操作对于颅内病变不易实施,而液体活检是一个相对无创、容易获取和可重复的监测手段[6]。在MB 患儿腰椎穿刺脑脊液中发现肿瘤细胞很早就已被报道,表明脑脊液可作为MB 患者获取疾病信息的途径[7]。近期对癌症患者的研究表明,从血浆、脑脊液和尿液等体液中提取cfDNA,捕获肿瘤相关基因组改变是可行的[8]。在MB 患者中,在手术前采集的脑脊液标本中检测到cfDNA 的占76.9%,相比之下,cfDNA 在血浆中除了1 例变异等位基因频率(variant allele frequencies,VAFs)很低的患者外都没有检测到,检出比例仅为2.2%,这表明cfDNA 在脑脊液中含量丰富,但在血浆中几乎不存在[9]。脑脊液cfDNA 可以揭示肿瘤的基因组改变,有利于确定分子分型和进行危险度分层,为诊断和预后提供了有价值的信息。同时脑脊液cfDNA 也检测到肿瘤内基因组异质性,可识别小亚克隆,对脑脊液cfDNA 的纵向分析可以了解微小残留疾病和肿瘤复发时基因组进化的特征。因此,脑脊液cfDNA 分析有助于MB 患者的临床管理,帮助设计有针对性的治疗策略,提高治疗效果,避免过度治疗[9]。

1 细胞游离DNA

细胞游离DNA(cell-free DNA,cfDNA),也称循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA),是指细胞转化为生物液体过程中释放的DNA 片段,可以通过基于PCR 技术或者下一代基因组测序(NGS)技术检测出来[10]。在创伤、感染和癌症等病理条件下,cfDNA 可以被检测到其浓度相对增加。研究发现,在一些恶性肿瘤患者的体内cfDNA 的含量显著增高,主要来源于肿瘤细胞或肿瘤邻近组织坏死及凋亡的释放。cfDNA 作为膀胱癌、大肠癌、胃食管癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌和头颈部癌等颅外恶性肿瘤的血清标志物被广泛研究,而其在脑肿瘤患者血清中以目前的基因测序技术检测的敏感性不高,不过有研究证实了脑脊液中cfDNA 比血清中的丰度更高[11],目前脑脊液液体活检在胶质瘤[12]、髓母细胞瘤[13]、中枢神经系统淋巴瘤[14]以及脑转移瘤[15]等脑肿瘤的研究中展现了很好的临床应用前景。因此,脑脊液cfDNA 可作为检测中枢神经系统恶性肿瘤表征的液体活检材料。

2 脑脊液cfDNA 在MB 中的临床应用

随着基因组测序技术的不断进步,源于脑脊液样本的cfDNA 检测的敏感度越来越高,不但发现所测脑脊液cfDNA 的基因组谱与原发肿瘤组织高度一致,而且还丰富于原发肿瘤组织[16]。脑脊液cfDNA 是可测量残余疾病(measurable residual disease,MRD)的标志物,MRD 指的是肿瘤患者经过系统治疗后体内残留的少量肿瘤细胞,它是MB 患者复发的主要原因[17]。通过对脑脊液 cfDNA 检测,有助于术后动态监测MB 患者的肿瘤标志物变化,对协助诊断、危险度分层、评估治疗反应、监测复发及预测提供依据,可作为脑肿瘤液体活检的主要方法[18]。因此,动态监测MB 患者脑脊液cfDNA 有助于这些患者的临床管理。

2.1 协助临床诊断

确定MB 的诊断、预后和治疗靶点都依赖于肿瘤的分子特征。目前MB 的定性取决于肿瘤标本的获取,手术切除是组织活检获取标本的主要方式,立体定向活检也是临床诊断常用的手段,然而实施颅脑肿瘤手术需要多方面考虑而不轻易实施,即使通过手术获取肿瘤组织,由于肿瘤内的异质性,检测到的局部肿瘤组织提供的关于肿瘤分子特征的信息可能不是全面的[9]。研究发现脑脊液cfDNA中的基因组改变再现了肿瘤中存在的基因组改变[6],因此,对脑脊液cfDNA 的分析成为识别MB 基因组特征的一种较无创的选择。

MB 主要发生在小脑中,患者常有脑积水的临床表现,常常需要在手术前进行脑脊液引流。脑脊液可以通过非侵入性的方式获得,而且脑脊液cfDNA 可在手术前得到分析,从而提供有关肿瘤的信息[19]。因此,脑脊液cfDNA 的检测可以为外科医生和肿瘤学家提供疾病的重要信息,以评估风险与利益之间的平衡,并指导手术、放疗和化疗等治疗策略。研究表明,MB 肿瘤组织内具有异质性,而且治疗过程中肿瘤基因组普往往发生改变[20]。因此,脑脊液活检可以提供一个动态的疾病诊断和治疗模式。

2.2 协助危险度分层

在2012 年,小儿神经肿瘤学界就MB 亚型达成了国际共识,报道了四个不同的MB 亚型,分别为WNT 激 活 型、SHH 激 活 型、Group 3 型 和Group 4型,它是MB 危险度分层的重要内容[21]。16 岁以下WNT 激活型的MB 患者通常预后较好,生存率>90%;而成人WNT 激活型的MB 患者预后不明确。SHH 激活型的 MB 患者表现出与不同诊断年龄、组织病理学和特定潜在遗传学相关的预后,例如SHH激活型可细分为TP53突变亚型和TP53野生亚型。Group 3 型和Group 4 型的生物学行为尚不清楚。MYC扩增是Group 3 型MB 的一个显著特征,发生在约15%-20%的患者中,并与不良的临床预后相关。染色质改变在Group 4 型MB 中很常见,总共约占30%-40%的患者。染色体17q 异常在Group 3 型和Group 4 型中都很常见[22]。2015 年海德堡会议结合MB 分子分型进行危险度分层,分子危险度分层根据5年生存率划分为四个组:低危组、标危组、高危组和超高危组[23],可见分子特征在MB 患者的危险度分层中具有重要意义。

基于cfDNA 脑脊液活检可再现MB 肿瘤内的分子特征。Escudero 等[9]在脑脊液cfDNA 中检测到MB 的关键分子改变,包括TP53和PTCH1突变,检测到MYCN和GLI2扩增以及SUFU缺失和染色体17p 缺失,这些分子的特征与原发肿瘤显著相关,表明脑脊液cfDNA 可为MB 分子诊断和风险度分层提供了丰富的信息。Liu 等[17]研究表明基线MRD 的检测与风险分组、肿瘤转移状态、分子亚组和肿瘤位置显著相关,这些变量皆是肿瘤危险度分层中的具体表现。因此,脑脊液活检可作为MB 危险度分层的重要补充。DNA 甲基化也适用于MB的危险度分层[24],Li 等[25]分析中MB SHH 和WNT两个分子亚型分组之间脑脊液cfDNA 的DNA 甲基化发现两者存在显著差异,证实了MB 脊液特征性CpGs 位点的DNA 甲基化状态可以用来识别MB 的分子亚型。因此,基于cfDNA 脑脊液活检可以协助MB 患者的危险度分层。

2.3 评估治疗反应

疗效观察是对治疗策略实施的反馈,脑脊液液体活检提供了可评估治疗反应的途径。研究发现,脑脊液cfDNA 再现了肿瘤的亚克隆基因组图谱,肿瘤中VAFs 与脑脊液中VAFs 有显著的相关性,这表明脑脊液cfDNA 可以表征肿瘤内MB 的异质性,从而有助于识别可促进耐药的小侵袭性克隆,从而指导改变治疗策略[9]。通过患者脑脊液cfDNA 的监测,能够识别微小的残留疾病和肿瘤的进化,用以评估肿瘤进展和对治疗的反应,从而调整治疗强度和持续时间以适应此时肿瘤的特定状态[17]。另外在表观遗传学的研究中,发现部分CpGs 位点在治疗期间出现DNA 甲基化水平的变化,这表明这些CpGs 的甲基化水平可以用来评估治疗反应[24]。综上,脑脊液活检可以通过检测肿瘤基因组图谱以及表观遗传学的改变来评估治疗反应。

2.4 监测复发

肿瘤复发是MB 患者死亡的主要原因。患者经过系统治疗后肿瘤复发及进展是患方和医生最为关注的问题,肿瘤复发时很少可以进行活检。然而在比较原发和复发肿瘤的基因突变情况的研究中,发现复发肿瘤中可能出现其他突变,复发肿瘤的基因组可能与原发肿瘤有所不同,肿瘤特征数据的缺乏可能对选择有效的二线治疗策略提出挑战[9]。Sun 等[20]发现MB 患者脑脊液cfDNA 的水平与肿瘤进展有关,从而认为脑脊液cfDNA 可以预测疾病的复发。Escudero 等[9]分析MB 患者脑脊液cfDNA 发现肿瘤VAFs 和拷贝数变异(copy number variations,CNVs)高度一致,结合患者影像学的随访结果,认为脑脊液cfDNA 监测可发现微小残留疾病,因此脑脊液cfDNA 可作为影像学和脑脊液细胞学的补充,用于早期发现肿瘤复发,指导治疗策略。Liu 等[17]分析MB 患者脑脊液样本cfDNA 以CNVs作为MRD 的标志物发现,12 例影像学或细胞学提示肿瘤复发患者的所有脑脊液样本(n=27) MRD均呈阳性;在观察到疾病进展的患者中,在3 个月内采集到的脑脊液样本24/25 例MRD 呈阳性;而没有观察到疾病进展的患者中,在基线时采集的193/209 份CSF 样本MRD 呈阴性;在没有影像学和/或细胞学异常之前,MRD 阳性的患者有16/32 例(50%)在3 个月(中位数为8.3 个月,区间为3.0-29.4个月)后影像学随访过程中提示肿瘤复发。另外从cfDNA 获取的肿瘤相关分子谱中发现10q 染色体丢失是MB 患者复发时普遍发生的改变。因此,认为脑脊液cfDNA 在MB 监测复发中具有较高的敏感性和特异性。

2.5 预测预后

MB 是恶性程度极高的脑肿瘤,人们往往关注疾病的预后。手术前了解患者的诊断和预后信息可以帮助确定哪些患者预后良好,可以从肿瘤保守切除以及化疗和放疗温和的剂量中受益。MRD 是一个风险修正因子和一个较短的无进展生存期(progression-free survival,PFS)的 指 标。脑 脊 液cfDNA 可将肿瘤划分为正确的分子亚型和危险亚组,并为预后提供重要信息。对脑脊液中cfDNA 的水平与肿瘤体积进行比较,但未观察到相关性,而在复发风险非常高的MB 患者术前的脑脊液检测到高水平cfDNA,并观察到疾病进展,脑脊液cfDNA的丰度可能是一个有价值的预后指标[9]。最后研究得到证实,Sun 等[20]采用下一代测序平台对脑脊液进行深度测序,58 例患者中只有15 例脑脊液中检测到cfDNA,发现cfDNA 的检出与肿瘤进展显著相关(P=0.003, Fisher’s exact test),因此,脑脊液液体活检在MB 的治疗及随访过程中可能提供有用的预后信息。随后Liu 等[17]在一项前瞻性研究中,连续检测MB 脑脊液cfDNA 评估MRD,发现MRD 阳性的患者PFS 明显低于MRD 阴性的患者。在基线时MRD 的 检 测 与 预 后 无 关(HR1.36, 95%CI0.67-2.76;Log rankP=0.4)。在放疗后、化疗中期和治疗结束时MRD 的检测与PFS 显著相关(放疗后:HR6.53,95%CI3.22-13.26,Log rankP<0.000 1;化疗中期:HR6.35, 95%CI3.06 -13.19,log rankP<0.000 1;治疗结束:HR8.94,95%CI4.10-19.49,log rankP<0.000 1)。在平均风险组的患者中,在放疗后、化疗中期和治疗结束时检测的MRD 与PFS 显 著 相 关(放 疗 后:HR49.63,95%CI:9.41-261.7;化 疗 中 期 :HR:11.19,95%CI:3.45-36.32;治 疗 结 束 :HR11.43,95%CI:3.60-36.31)。在高危风险组的患者中,治疗结束时MRD 的 检 测 与PFS 显 著 相 关(HR4.71,95%CI1.56-14.21);在放疗后和化疗中期时MRD 的检测与PFS 的相关性趋于显著(放疗后:HR2.91,95%CI0.85-9.95;化 疗 中 期:HR2.62, 95%CI0.97-7.07)。这些研究结果表明,治疗过程中监测脑脊液cfDNA 评估的MRD 与预后相关,可提供一定的预后信息。因此,脑脊液活检有利于动态且实时地了解患者的预后信息。

3 肿瘤进展时基因组谱的变化

通过脑脊液cfDNA 与肿瘤组织的基因组进行比较,发现两者间存在广泛的共同基因特征,也发现脑脊液cfDNA 肿瘤相关基因突变比肿瘤组织的更丰富,表明脑脊液液体活检有着比组织活检更加全面的基因组景观[19]。

MB 复发时肿瘤组织和脑脊液样本的基因测序揭示了两者存在共同的突变,包括四个预测的驱动子:PTCH1:p.L1024Pfs、TP53:p.N239Tfs、CDKN2B: p.G124D 和KMT2A: p.W1199S。PTCH1和CDKN2B的突变在肿瘤和正常脑组织的DNA 及脑 脊 液 和 血 浆 的cfDNA 得 到ddPCR 验 证[20]。对CNVs 的分析也发现MYCN扩增的存在,这些原发肿瘤相关的特异性突变提供了复发时MB 对SMO抑制剂的耐药信息。脑脊液cfDNA 测序也发现了肿瘤特异性突变KMT2A:p.W1199S,该突变驱动子经ddPCR 得到验证。笔者认为这些脑脊液特异性突变可能因为肿瘤的异质性在肿瘤活检分析中被遗漏。尽管脑脊液cfDNA 的含量有限,但也检测到原发肿瘤中发现的突变和相关的基因组改变,包括MYCN和GLI2的 扩 增 以 及17p 的 部 分 损 失[20]。另外在复发时的脑脊液cfDNA 分析显示了一种基因组转化,其分子特征与原发性或首次复发的肿瘤不同,当脑脊液cfDNA 水平下降时,在复发的原发肿瘤中检测到HCN1:p.Q828*的突变,而脑脊液cfDNA 未检测到;相反,在出现疾病进展复发后的81 d 内,测得脑脊液的ctDNA 改变水平平稳或升高,尸体活检提示ADD1:p.P718L VAFs: 41.6-52%和ACTA2:p.Y190S VAFs: 13.2-15%[20],这些结果表明脑脊液cfDNA 的分析可用于监测肿瘤基因组的进化。Liu 等[17]分析脑脊液cfDNA CNVs 谱的染色体非整倍体提示在12/15 例(80%)患者中出现克隆选择或进化。染色体10q 丢失是肿瘤复发时染色体10q 丢失,表明染色体10q 丢失与肿瘤复发相关,而复发时SMAD2和PIM1扩增等特异性的局灶性遗传改变独立存在。总之,脑脊液活检可以检测到肿瘤复发时不同于原发肿瘤的基因谱改变。

表观遗传学改变也是肿瘤复发的驱动因素。Li等[25]通过脑脊液液体活检对cfDNA 进行表观遗传学分析,发现MB 患者疾病复发时脑脊液cfDNA 不同的CpGs 甲基化水平较复发前升高或者减少,连续的脑脊液样本cfDNA 甲基化变化与肿瘤复发相关。因此,肿瘤复发时的脑脊液cfDNA 甲基化情况是有差异的。

4 小结

基因组学和表观遗传学的深入研究革新了肿瘤的治疗方式。MB 在肿瘤内和肿瘤间表现出空间上和时间上很大的异质性,脑脊液液体活检可以对MB 进行表征和监测,对这些样本中存在的cfDNA的CNVs 进行分析,可以作为一种生物标志物,以确定MRD 的存在,有助于预测MB 患者的诊断、预后和靶向治疗反应,实现系统监测,为肿瘤耐药机制的研究提供途径,促进MB 患者的最佳治疗和临床管理[13]。人类癌症的治疗已经转向精准治疗的医学模式,靶向治疗的选择将依赖于个体患者的基因表型,脑脊液液体活检是对于MB 组织学诊断和影像学诊断的重要补充。因此,基于脑脊液cfDNA 的液体活检能为MB 的临床治疗提供有效的帮助。

作者贡献度说明:

所有作者声明不存在任何利益冲突。

符炳彪:论文选题、撰写与修改;赵泽宇、安思龙和陈华帅:论文审阅与修改;赵建农:指导老师。

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