异甘草素通过激活PPAR-γ 信号通路调控ox-LDL 稳定动脉粥样硬化斑块

许心蕊，高 照，张晴玥，杨漫芳，孙 浩，冯 露，王添钰，李 洋，娄利霞，吴爱明，聂 波，

（1.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室，北京 100700；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海200032；3.北京中医药大学中药学院，北京 100029；4.北京中医药大学东直门医院病理科，北京 100700）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是脂质驱动的慢性炎症反应，是心血管疾病的主要病理基础，其特征是脂质代谢紊乱、内膜下氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）沉积和炎症反应，泡沫细胞积聚和斑块形成［1］。Ox-LDL 被认为是AS 进展的主要触发因素之一［2］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ （peroxisome proliferator-activated receptor γ， PPAR-γ）信号通路能够调控脂代谢使其成为治疗代谢性疾病的关键靶点。在AS 进展中，通过改善ox-LDL 脂质代谢紊乱，发挥稳定粥样斑块作用，是防治AS 的重要机制之一［3］。本研究团队前期实验证实四妙勇安汤通过激活PPAR-γ，抑制FABP-4 表达，拮抗ox-LDL 脂代谢途径，从而稳定斑块，具有AS 保护作用［4］。采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 技术在四妙勇安汤及其入血成分中均鉴定有异甘草素等原型成分［5］。在筛选的PPAR-γ 激动剂四妙勇安汤活性部位CS05中鉴定得到异甘草素［6］，经过分子对接验证异甘草素具有较强激活PPAR-γ 的活性。网络药理学筛选出异甘草素是四妙勇安汤发挥抗炎作用的主要成分［5］，文献报道异甘草素的研究主要集中在抗肿瘤方面［7］，对AS 的药理作用及机制报道很少。因此，本研究在前期实验初步验证异甘草素具有抗AS 的作用基础上，从PPAR-γ 信号通路调控ox-LDL 代谢途径探讨异甘草素对于ApoE-/-小鼠AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物与饲料 C57BL/6J 小鼠，雄性，7周龄；ApoE-/-小鼠，雄性，7 周龄，体重（20±2） g，由北京维通利华实验动物中心提供［许可证号：SCXK（京）2021-0011］。动物饲养于北京中医药大学东直门医院屏障级动物房（动物房编号：SYXK（京）2020-0013），饲养环境：温度恒定22～24 ℃，湿度50%，明暗交替12 h 一次。

高脂饲料配方由15% 脂肪、0.25% 胆固醇及84.75%基础饲料组成，购买于北京华阜康科技有限公司，其许可证号为：SCXK（京）2014-0008。

1.1.2 药物与试剂 异甘草素（批号：Y-008-181216），购买于成都瑞芬思生物科技有限公司。小鼠ox-LDL ELISA 检测试剂盒（货号：E-ELM0066c）购买于武汉Elabscience 生物科技有限公司。饱和油红O 染色液（货号：G1260）、改良Masson 三色染色试剂盒（货号：G1346-50）均购自北京索莱宝科技有限公司。 抗体α-SMA（货号：ab124964）、MOMA-2（货号：ab33451）、PPAR-γ（货号：ab45036）、LXR-α（货号：ab106464）、FABP-4（货号：ab92501）、MMP-2（货号：ab37150）、MMP-9（货号：ab38898）、GAPDH（货号：ab9485）均购自英国Abcam 公司。HRP 羊抗兔IgG 抗体（货号：C1309）、BCA 蛋白定量试剂盒（货号：P1511）、RIPA 裂解液（货号：C1053）、脱脂奶粉（货号：P1622）均购于北京普利莱基因技术有限公司。一步法PAGE 凝胶快速制备试剂盒（货号：PG212）购自上海雅酶生物医药科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 AU5800 全自动生化测定仪（美国BECKMAN COULTER 公司）；EG1150 组织包埋机（德国Arcadia 公司）；RM2135 组织切片机（德国Arcadia 公司）；MK3 全自动酶标仪（美国Thermo公司）；LF-mini 3 小型垂直电泳槽、LF-ZY01 小型转印电泳槽（北京龙方科技有限公司）；Tanon-5200 凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及分组给药 参照文献［8］，采用高脂饲料喂养联合右侧颈总动脉外置套管术（perivascular carotid collar placement，PCCP）制备AS 模型。20 只ApoE-/-小鼠适应性喂养1 周后，高脂喂养2 周，实行PCCP 术。小鼠麻醉后，颈部至腋下脱毛，于颈右侧部剪开约2 cm 切口，暴露右侧颈总动脉，将长度约2.5 mm，内径为0.3 mm 的硅胶套管套置于血管外周，并固定套管的上下端。术后将小鼠随机分为模型组和异甘草素组，每组10 只。PCCP 术后当天起，异甘草素组小鼠以40 mg/kg 的给药剂量每天灌胃给药1 次，连续灌胃8 周，同时高脂饲料喂养。模型组给予相同剂量的去离子水灌胃。10 只C57BL/6J 小鼠设为正常组，基础饲料喂养，灌胃相同剂量的去离子水，饲养周期与造模小鼠一致。

1.2.2 全自动生化仪检测血清中血脂含量 造模完成后对小鼠进行取材，以摘眼球取血的方式收集小鼠血液，4 ℃，3 000 r/min，离心15 min 后收集血清，采用全自动生化仪检测血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）含量。

1.2.3 酶联免疫吸附（ELISA）检测血清中ox-LDL水平 按照ELISA 试剂盒操作说明，检测血清中ox-LDL 水平。

1.2.4 颈动脉斑块病理形态特征 小鼠取血后，取右侧颈动脉，经4% 多聚甲醛固定后，脱水后行OCT 包埋和石蜡包埋。HE 染色观察斑块病理形态。油红O 染色和Masson 染色用于斑块内脂质和胶原含量分析。MOMA-2 和α-SMA 免疫组化染色用于巨噬细胞和平滑肌细胞分析。应用Image Pro Plus 6.0 图像处理软件测量血管内膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、斑块面积（PA）和血管管腔面积（LA），并计算IT/MT 以及PA/LA［9］，并对斑块内脂质、胶原、MOMA-2 和α-SMA 含量进行测定，计算易损指数，易损指数（%）=（MOMA-2 阳性面积百分比+脂质阳性面积百分比）/（胶原阳性面积百分比+α-SMA 阳性面积百分比）×100%。

1.2.5 Western blot 检 测 主 动 脉PPAR-γ、LXR-α、FABP-4、及MMP-2、MMP-9 蛋白表达 主动脉加入适量蛋白酶抑制剂，超声破碎，离心收集上清液，BCA 法测量蛋白浓度。取等量蛋白上样进行电泳，蛋白转移至NC 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗PPAR-γ（1∶1 000）、LXR-α（1∶1 000）、FABP-4（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日，TBST 洗膜后加入羊抗兔二抗（1∶5 000），室温摇床1 h，TBST 洗膜后，ECL 发光液显色，凝胶程序系统中曝光、拍照。使用Image J 软件分析条带灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0 软件进行数据分析，计量资料以平均值±标准差（±s）表示，对数据进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的多组间样本比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 法。非正态分布采用非参数检验。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 异甘草素对AS 小鼠血脂的影响

与正常组比较，模型组小鼠TC、TG、LDL-C 和HDL-C 均增加明显（P<0.01）。与模型组比较，异甘草素组TC、TG 和LDL-C 降低（P<0.05），HDLC 未见明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

图1 异甘草素对AS 小鼠血脂的影响Fig 1 Effect of isoliquiritigenin on lipids in AS mice

2.2 异甘草素对AS 小鼠血清ox-LDL 的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清ox-LDL 显著升高（P<0.01）；与模型组比较，异甘草素组小鼠血清中ox-LDL 明显降低（P<0.01），见图2。

图2 异甘草素对AS 小鼠ox-LDL 的影响Fig 2 Effect of isoliquiritigenin on ox-LDL in AS mice

2.3 异甘草素对AS 小鼠颈动脉病理形态的影响

正常组的血管壁完整光滑，内中膜结构完整，未见斑块生成。模型组可见内膜不光滑，内中膜厚度不均，中膜平滑肌细胞排列严重紊乱，内膜隆起形成斑块凸向管腔，IT 显著增厚（P<0.01），IT/MT明显增加（P<0.01），PA 明显增加（P<0.01），PA/LA 明显增加（P<0.01）。与模型组比较，异甘草素组颈动脉内膜不光滑，IT 降低（P<0.01），内中膜厚度不均，中膜增厚，IT/MT 降低（P<0.01），管腔内PA 明显减小（P<0.01），管腔阻塞程度降低，见图3，4。

图3 异甘草素对AS 小鼠颈动脉病理形态的影响（HE 染色，×200）Fig 3 Effect of isoliquiritigenin on the pathological morphology of carotid artery in AS mice（HE staining， ×200）

图4 异甘草素对AS 小鼠颈动脉影响Fig 4 Effect of isoliquiritigenin on carotid in AS mice

2.4 异甘草素对AS 小鼠颈动脉斑块内脂质、胶原、MOMA-2、α-SMA 含量的影响

与正常组比较，模型组颈动脉斑块内脂质沉积和MOMA-2 含量较多（P<0.01），胶原含量和α-SMA 含量较少（P<0.01），斑块易损指数增加（P<0.01）。与模型组比较，异甘草素组斑块内脂质和MOMA-2 含量明显减少（P<0.01），胶原和α-SMA含量增加（P<0.01），斑块易损指数降低（P<0.01），见图5，6。

图5 异甘草素对AS 小鼠颈动脉斑块病理形态的影响（×200）Fig 5 Effect of isoliquiritigenin on pathological morphology of carotid plaque in AS mice（×200）

图6 异甘草素对AS 小鼠斑块易损指数的影响Fig 6 Effect of isoliquiritigenin on plaque vulnerability index in AS mice

2.5 异甘草素对AS 小鼠脂代谢PPAR-γ、LXR-α和FABP-4 蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组PPAR-γ、LXR-α 蛋白表达水平明显减少（P<0.01）。与模型组比较，异甘草素 组PPAR-γ、LXR-α 蛋 白 表 达 水 平 增 加（P<0.01）。与正常组比较，模型组FABP-4 蛋白表达水平明显增加（P<0.01）。与模型组比较，异甘草素组FABP -4 蛋白表达水平明显减少（P<0.01），见图7。

图7 异甘草素对AS 小鼠PPAR-γ、LXR-α 和FABP-4 蛋白表达影响Fig 7 Effect of isoliquiritigenin on the expression of PPAR-γ， LXR-α and FABP-4 proteins in AS mice

2.6 异甘草素对AS 小鼠斑块稳定性蛋白MMP-2、MMP-9 表达的影响

与正常组比较，模型组MMP-2 和MMP-9 蛋白表达水平明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。与模型组比较，异甘草素组MMP-2 和MMP-9 蛋白表达水平减少，差异具有统计学意义（P<0.05），见图8。

图8 异甘草素对AS 小鼠MMP-2 和MMP-9 蛋白表达的影响Fig 8 Effect of isoliquiritigenin on the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins in AS mice

3 讨论

AS 是心血管疾病发病和死亡的主要原因［10］，脂质代谢紊乱是AS 的病理基础。异甘草素是甘草中主要的黄酮类化合物［11］，是四妙勇安汤的有效成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化，以及免疫调节，保护心脏的作用［12］。研究表明异甘草素能够改善ApoE-/-小鼠血脂情况［13］，本实验结果显示异甘草素能够降低AS 小鼠血清中TC、TG、LDL-C 和ox-LDL 的含量，改善AS 小鼠血脂情况。病理结果表明，模型组颈动脉内中膜厚度不均，管腔内有较大斑块堵塞。相较于模型组，异甘草素给药后，小鼠颈动脉血管IT、PA 减少，PA/LA 降低，斑块面积减小，管腔堵塞减轻，AS 小鼠颈动脉病理形态得到改善。可见，异甘草素能够降低血脂水平，减少ox-LDL 的含量，改善血管病理形态，发挥对AS 的保护作用。

易损斑块形成、斑块出血、破裂及血栓形成是导致急性心血管事件的主要原因［14］。Ox-LDL 与脂质坏死核心的形成有关，是易损斑块的重要特征［15］。巨噬细胞摄取ox-LDL 变为泡沫细胞［16］，泡沫细胞形成、凋亡并融合演变成脂质坏死核心，降低斑块稳定性［17］。清除循环中ox-LDL 能够减少坏死核心并增加斑块稳定性，抑制AS 进展［18］。胶原是纤维帽内细胞外基质主要组成成分，斑块胶原含量在阻止斑块破裂方面具有重要作用，并且可以增加AS 斑块的稳定性［19］。本实验研究结果显示：模型组斑块内含有较多的脂质和MOMA-2 含量，而胶原和α-SMA 含量较少，表现出易损斑块特征。异甘草素能够降低ox-LDL 含量，减少斑块内脂质和MOMA-2 含量，增加胶原和α-SMA 含量，降低斑块易损指数，防止斑块破裂。

异甘草素对AS 的保护作用机制涉及PPAR-γ依赖性信号通路［20］。PPAR-γ 是一类配体激活的核受体，在维持代谢稳态方面起重要作用，能够促进细胞内胆固醇流出［21］。巨噬细胞经PPAR-γ 阻断后增加胆固醇蓄积，诱导泡沫细胞形成［22］。相反，激活PPAR-γ 增 加 下 游 蛋 白 肝X 受 体α（Liver X Receptor-α，LXR-α）转录［23］，拮抗ox-LDL 摄入，增强胆固醇外排，减少脂质聚积［24］，从而增加斑块的稳定性。脂肪酸结合蛋白4（Fatty acid binding protein 4，FABP-4）在脂质代谢中起着中心调节的作用，通过增加ox-LDL 诱导的细胞内脂质积聚促进泡沫细胞转 化［25］，是PPAR-γ 的 主 要 靶 基 因，且 负 向 调 节PPAR-γ 表达，产生与其相反的作用［26］。本实验结果显示：模型组PPAR-γ、LXR-α 表达降低，FABP-4表达增加，斑块内脂质增多，不稳定性增加。异甘草 素 能 够 激 活PPAR-γ，增 加LXR-α 表 达，降 低FABP-4 表达，减少ox-LDL 摄入，减少斑块内脂质含量，从而稳定AS 斑块。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是评价斑块不稳定性的重要指标［27］。Ox-LDL 水平升高加剧血管壁的损伤，增加泡沫细胞不断聚集，同时增加MMPs 的分泌［28］，增加斑块不稳定性。MMP-2 和MMP-9 是影响斑块稳定性的主要蛋白酶，能降解细胞外基质中的胶原，使纤维帽变得薄弱而易于破裂［29］。PPAR-γ 在维持AS 斑块的稳定性方面起重要作用，在调控ox-LDL 的同时，能够抑制MMP-9 和MMP-2 表达［30］。本 研究结果显示异甘草素能够激活PPAR-γ，降低MMP-2 和MMP-9 的表达，从而增加AS 斑块稳定性。

综上，异甘草素能够通过激活PPAR-γ，上调LXR-α，减少FABP-4 表达，降低血脂和ox-LDL 水平，减少斑块不稳定性相关蛋白MMP-2 和MMP-9的表达，降低斑块易损指数，从而发挥抗AS 的作用。

前期的动物实验，分子对接和网络药理学综合说明异甘草素具有PPAR-γ 激动作用，并能起到抗AS 的作用。动物实验主要目的是进一步验证异甘草素的抗AS 的药效作用，并探讨其作用机制。深入的机制探讨将在后面的细胞实验中开展，进一步明确异甘草素是通过激活PPAR-γ 发挥抗AS 的作用机制。

作者贡献度说明：

聂波：实验设计、指导及论文校审；许心蕊：指标检测、数据分析、论文撰写；高照：实验造模、药物干预；孙浩：病理指标检测；张晴玥、冯露、杨漫芳、李洋、王添钰：实验取材及指标检测；吴爱明、娄利霞：病理实验及Western Blot 实验技术指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。