肝细胞生长因子对CCl4致肝细胞损伤相关炎性因子的影响

段 琪，李思玥，李清兰，王 宇，郑 力

（海南医学院，海南 海口 571199）

吴斌等［7］对肝细胞生长因子对CCl4致急性肝损伤的保护作用进行研究，发现其对于受损肝细胞质膜有一定保护作用，邹原等［8］深入研究HGF 在发挥对受损肝细胞的保护作用时，可使肝再生相关基因表达水平提高［9］。另有研究表明HGF 可抑制大鼠急 性 肝 损 伤 中 炎 症 因 子TNF-α 的 释 放［10，11］。为 探讨HGF 对CCl4所致小鼠肝损伤保护作用的机制，本实验将通过建立CCl4损伤肝细胞小鼠模型，采用Elisa 法分别检测肝实质细胞和白细胞中炎性因子TNF-α、IL-8、IL-4、IL-21 的表达水平，研究肝细胞生长因子对CCl4致肝细胞损伤相关炎性因子的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小鼠购自长沙市天勤生物技术有限公司，Percoll 细胞分离液（Solarbio）、重组人HGF 蛋白购自海南省莱博科达科技有限公司，RPMI-1640 完全培养基购自Gibco 公司，小鼠IL-8、IL-21、TNF-αELISA试剂盒购自上海抚生实业有限公司，小鼠 IL-4 ELISA 试剂盒购自上海优宁生物科技股份有限公司，高速台式离心机购自Eppendorf 公司，SPX-250B-Z生化培养箱购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，电子天平购自上海上天精密仪器有限公司，Life Real P-800 多波段酶标仪购自杭州遂真生物科技有限公司。

1.2 动物分组及细胞处理

SPF 级雌性C57BL/6 小鼠6 只，体质量范围在18～22 g。将小鼠随机分为CCl4损伤组和正常对照组，每组各3 只。所有小鼠适应性喂养7 d，期间自由饮水、摄食。第8 天，给CCl4损伤组每只小鼠按10 mL/kg 的剂量腹腔注射0.2% CCl4蓖麻油溶液，复制小鼠急性肝损伤模型。正常对照组的小鼠，在同一部位注射相同剂量的蓖麻油溶液。

18 h 后，小鼠眼眶静脉丛取血后麻醉，充分暴露小鼠腹腔，采用三通管和静脉留置针将门静脉、蠕动泵软管以及下腔静脉连接成回路，自门静脉端注入37 ℃的0.2 mg/mL 的胶原酶液，调节蠕动泵转速为20 mL/min 行循环灌注，摘除肝脏剪切成小块组织，加入0.5 mg/mL 胶原酶液消化30 min 后碾碎［12］过200 目筛网，将过滤后的细胞混悬液置于33%Percoll 之上［13］，梯度离心后上层为小鼠肝实质细胞，下层为红细胞与肝白细胞的混合细胞层。向其中加入红细胞裂解液后收集肝脏白细胞， PBS 洗涤两次后，细胞计数5×105/mL 后种24 孔板。

1.3 体内损伤实验分组

实验分为受损肝实质细胞组，10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL HGF 实验组。取24 孔板，每孔加入500 μL CCl4损伤组肝实质细胞。10 ng/mL 实验组加 入20 μL HGF，25 ng/mL 实 验 组 加 入50 μL HGF，50 ng/mL 实验组加入100 μL HGF；每组设两个复孔。肝脏白细胞刺激方法同上。

1.4 体外损伤实验分组

将正常对照组肝实质细胞及白细胞计数后种板，每孔2.5×105细胞于24 孔板37 ℃培养4 h 后，加入40 μL 100 mmol/L CCl4，以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1%（体积分数），作用3 h。将处理后的肝实质细胞分为正常肝实质细胞组，CCl4损伤组，10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL HGF实验组，每孔加入500 μL 肝实质细胞，10 ng/mL 实验组加入20 μL HGF，25 ng/mL 实验组加入50 μL HGF，50 ng/mL 实验组加入100 μL HGF；每组设两个复孔。肝脏白细胞刺激方法同上。

1.5 Elisa 检测

收集各组上清液，按Elisa 检测试剂盒说明书检测IL-8、TNF-α、IL-4、IL-21 ，酶标仪450 nm 检测吸光度，计算浓度值。

1.6 统计学处理

数据统计分析采用GraphPad Prim 5.01，统计学方法使用t检验or Wilcoxon matched pairs test。当P<0.05 时，拒绝假设检验，存在显著性差异。

2 结果

2.1 HGF 对体内注射CCl4损伤模型肝实质细胞分泌IL-8、TNF-α、IL-4、IL-21 的影响

检测结果显示，对于CCl4体内损伤肝实质细胞产生TNF-α、IL-21，与损伤肝细胞组相比，HGF（10、25、50 ng/mL）组无统计学意义；组间亦无差异。见图1B，D。对于IL-8，与损伤肝细胞组相比，10 ng/mL HGF 组 表 达 水 平 降 低（t=2.876，P=0.045 2），而25 ng/mL、50 ng/mL HGF 组无统计学意义。50 ng/mL HGF 组与10 ng/mL HGF 组相比表达水平升高（t=3.551，P=0.023 8），其他组间相比均无差异。见图1A。对于IL-4，与损伤肝细胞组相比，25 ng/mL HGF 组表达水平降低（t=2.981，P=0.045 2），50 ng/mL HGF 组表达水平亦降低（t=3.097，P=0.023 8），而10 ng/mL HGF 组无统计学意义。见图1C。

按照每月练兵成绩，对照考核细则，对当月练兵成绩优秀的队员进行奖励，并对成绩不达标的队员进行惩罚，考核结果兑现在当月工资中。同时，全年的考核情况也为年底评先选优的重要依据，练兵中出现不合格情况的队员，不在岗位标准作业流程先进个人评选范围。

图1 不同浓度HGF 对CCl4体内损伤小鼠肝实质细胞分泌4 种细胞因子的影响Fig 1 Effects of different concentrations of HGF on the secretion of four cytokines by liver parenchymal cells in CCl4-induced liver injury mice

2.2 HGF 对体内注射CCl4损伤模型肝脏白细胞分泌IL-8、TNF-α、IL-4、IL-21 的影响

检测结果显示，对于CCl4体内损伤白细胞产生IL-8、IL-4、IL-21，与CCl4模型组相比，HGF 不同浓度（10、25、50 ng/mL）组无统计学意义；组间亦无差异。见图2A、C、D。对于TNF-α，与CCl4模型组相比，10 ng/mL HGF 组表达水平降低（t=2.534，P=0.032 2），25 ng/mL HGF 组表达水平亦降低（t=2.601，P=0.030 0），50 ng/mL HGF 组 无 差 异。HGF 不同浓度10、25、50 ng/mL 组之间比较差异无统计学意义。详见图2B。

图2 不同浓度HGF 对CCl4体内损伤小鼠肝脏白细胞分泌4 种细胞因子的影响Fig 2 Effects of different concentrations of HGF on the secretion of four cytokines by liver leukocytes in CCl4-induced liver injury mice

2.3 HGF 对CCl4体外损伤肝细胞分泌IL-8、TNF-α、IL-4、IL-21 的影响

检测结果显示，对于IL-8、IL-21，正常对照组与CCl4模型组相比无差异，HGF（10、25、50 ng/mL）组与正常对照组和CCl4模型组比较差异无统计学意义，组间亦无差异。见图3A、D。对于TNF-α，正常对照组，HGF（10、25、50 ng/mL）组与CCl4模型组相比无差异，组间亦无差异。对于正常对照组，与10 ng/mL HGF 组比较差异无统计学意义；25 ng/mL HGF 组比较表达水平降低（t=3.236，P=0.031 8），50 ng/mL HGF 组比较差表达水平亦降低（t=3.344，P=0.028 7）。见图3B。对于IL-4，正常对照组，HGF（10、25、50 ng/mL）组与CCl4模型组相比无差异，组间亦无差异。对于正常对照组，与10 ng/mL ，50 ng/mL HGF 组比较差异均无统计学意义，与25 ng/mL HGF 组相比表达水平降低（t=4.946，P=0.015 9）。见图3C。

图3 不同浓度HGF 对CCl4体外损伤小鼠肝实质细胞分泌4 种细胞因子的影响Fig 3 Effects of different concentrations of HGF on the secretion of four cytokines by liver parenchymal cells in CCl4-induced liver injury mice in vitro

2.4 HGF 对CCl4体外损伤白细胞分泌IL-8、TNFα、IL-4、IL-21 的影响

检测结果显示，对于IL-8、IL-4，正常对照组与CCl4模型组、10、25、50 ng/mL HGF 组相比，差异无统计学意义，组间亦无差异。详见图4A，4C。对于TNF-α，与CCl4模型组相比，正常对照组、HGF（10、25、50 ng/mL）组差异无统计学意义；组间亦无差异。50 ng/mL HGF 组与10 ng/mL HGF 组之间比较表达水平升高（t=9.168，P=0.000 8），而25 ng/mL HGF 组 与50 ng/mL HGF 10 ng/mL HGF 组 之间比较差异无统计学意义。详见图4B。对于IL-21， 正常对照组与CCl4模型组之间比较表达水平降低（t=3.208，P=0.009 4），与正常对照组相比，10 ng/mL HGF 组、25 ng/mL HGF 组、50 ng/mL HGF组与正常对照组之间比较表达水平均降低（t=2.889、P=0.013 6，t=3.020、P=0.012 9，t=2.789、P=0.023 6），HGF（10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL）组与CCl4模型组之间比较差异均无统计学意义，组间比较亦无差异。详见图4D。

图4 不同浓度HGF 对CCl4体外损伤小鼠肝脏白细胞分泌4 种细胞因子的影响Fig 4 Effects of different concentrations of HGF on the secretion of four cytokines by liver leukocytes in vitro in CCl4-induced liver injury mice

3 讨论

CCl4是一种选择性肝毒性物质，在肝内通过肝微粒体细胞色素酶P450 氧化酶激活后， 产生三氯甲基自由基，可引发活性氧自由基的产生和脂质过氧化反应， 损伤肝细胞从而分泌大量炎性因子［14］。为探究HGF 对受损肝脏产生炎症反应的作用，本研究使用不同浓度HGF 刺激，CCl4所致体内、体外损伤的小鼠肝实质细胞、肝脏白细胞，检测促炎因子IL-8，TNF-α，IL-21 及抗炎因子IL-4 的变化。

研究结果表明HGF 对CCl4体内损伤小鼠肝脏细胞炎性因子IL-8，IL-4 的表达均有抑制作用，且10 ng/mL HGF 为抑制IL-8 表达水平最适宜浓度。IL-8 是机体内重要的中性粒细胞趋化因子，其通过激活中性粒细胞，促进胞内溶酶体活化和吞噬，进而引起局部炎症反应［15］，IL-4 是一种抗炎因子，具有抑制炎症反应、减轻肝脏损伤的作用［16］。与马玉珍等［17］不同，本实验建立18 h 内急性肝损伤模型，小鼠肝脏在早期炎症反应中IL-4 水平上升［18，19］，实验结果中对于IL-4 浓度的降低提示HGF 对于肝实质细胞的炎症反应具有抑制作用。

CCl4体外刺激肝实质细胞实验结果显示，CCl4与HGF 联合刺激小鼠肝实质细胞可以使其分泌TNF-α、IL-4 的浓度降低，且10 ng/mL HGF 为抑制肝实质细胞TNF-α 表达水平最适宜浓度。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞系统产生的单核细胞因子，具有免疫调节和促炎活性，不仅能够活化单核细胞和巨噬细胞，提高其杀伤活性，还可诱导多种黏附因子的表达和细胞化学趋化素的产生。机体炎症、损伤和休克等可导致其异常分泌，是介导肝损伤的主要和终末介质［16，20-23］。贺芳等［24］研究表明，TNF-α 水平与体内炎症反应呈正相关，实验中CCl4损伤小鼠肝实质细胞后未见明显差异，可能是由于实验组小鼠数量较少。实验结果显示加入HGF 后TNF-α 表 达 水 平 明 显 降 低，提 示HGF 可 能具有抑制小鼠肝实质细胞分泌TNF-α 的作用。综上，HGF 可抑制受损小鼠肝脏细胞TNF-α 的表达水平，这与贾俊清等［25］实验结果相似。

在体内刺激中，HGF 对小鼠肝脏白细胞分泌炎性因子TNF-α 具有抑制作用，而对肝实质细胞的作用却不明显。这与李丽媛等［26］研究结果一致。实验使用密度梯度离心法，将肝脏细胞分为肝实质细胞及肝脏白细胞分别研究HGF 对于两种细胞分泌炎性因子TNF-α 的抑制作用。结果显示，HGF 对小鼠受损肝脏白细胞分泌炎性细胞因子TNF-α 的抑制作用更明显。在小鼠肝脏白细胞体外试验中，CCl4与HGF 联合刺激白细胞，HGF 浓度与IL-21 浓度水平无明显关联。而IL-21 作为启动或促进组织炎症反应并导致损伤的主要炎性因子，在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等与免疫相关的疾病中可高水平表达，并且随疾病的控制表达下降，这表明IL-21 在介导炎症的产生与加重、组织病理损伤的过程中可能具有促进作用［27］。与艾国等［28］IL-21 的表达水平与肝脏炎症活动呈正相关的研究结果不同，可能是由于在炎症早期肝脏白细胞的IL-21 尚未大量表达。

通过感染腺病毒的小鼠受损肝模型，有研究显示HGF 改善了病毒性肝炎症状，降低TNF-β、IFNγ 等表达［29］。而在通过α-萘异硫氰酸酯建立肝损伤模 型 中，HGF 能 使TNF-α 表 达 降 低，调 节 肝 炎 反应［30］。对于这两种肝损伤模型引起的肝脏炎症活动，HGF 均可通过降低其炎性因子的表达来改善肝脏炎症。

CCl4体内损伤肝细胞实验结果与体外刺激并不完全一致，这可能是因为体内途径损伤肝脏，刺激小鼠全身免疫细胞分泌细胞因子，而体外实验仅刺激的肝细胞。CCl4在体内引起的复杂的连锁反应尚需进一步实验探究。炎性因子作为肝脏产生炎症的先行者，可作为研究者判断组织受损程度及是否发生炎症反应的指标，而其引起肝脏炎症反应的机制尚待深入研究。

作者贡献度说明：

段琪、郑力：负责实验设计；段琪、李清兰、李思玥、王宇：主要参与验实施；段琪：负责数据分析；段琪、郑力：负责论文撰写和修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。