百里香酚微囊的制备与评价

李宇伟,连瑞丽,马梦菲,张桂枝,娄 飞,曲书昊

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院,河南 郑州 450046;2.河南牧业经济学院 动物科技学院,河南 郑州 450046;3.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心,河南 郑州 450046)

规模化养殖中抗生素的滥用,使得药物残留超标,严重影响食品安全,威胁人类健康。植物精油来源于天然植物,具有抗菌、抗氧化、调节免疫力等多种作用[1,2],植物精油作为替抗功能性添加剂产品之一,引起了国内外学者的广泛关注。百里香酚具有促进生长[3]、抑菌消炎[4,5]、抗氧化[6,7]、提高免疫力等药理作用[6-8],但其稳定性差、易挥发,直接应用于畜禽疾病防控存在很大的局限性,不能达到预期的效果。微囊是固态或液态药物被壁材包裹成圆球形,使药物到达靶细胞后缓慢释放药物,减少药物对胃肠道的损伤,减少毒副作用,使药物稳定性增强等[9-11]。本试验通过百里香酚的微囊包被技术,采用单因素试验与正交试验优化百里香酚微囊的制备工艺,并对微囊进行质量评价,为植物精油“替抗”产品的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

百里香酚购自天津市科密欧化学试剂有限公司;壳聚糖、50%戊二醛、阿拉伯胶购自天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇购自德州曼巴商贸有限公司;10%氢氧化钠溶液购自西陇科学股份有限公司;10%醋酸溶液购自成都市科隆化学品有限公司。

1.2 主要试验仪器

101-3A型电热鼓风干燥箱购自天津市泰斯特仪器有限公司;85-2A型磁力搅拌器购自常州润滑有限公司;SHB-III型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;SQP型万分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器北京有限公司;TU-1810SPC型紫外-可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司;CKX53型倒置相差荧光显微镜购自奥林巴斯公司中国公司;ZRS-8G型溶出度测定仪购自天津市精拓仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 百里香酚微囊的制备

采用复凝聚法制备百里香酚微囊[12,13],称量0.5 g壳聚糖置于烧杯中,加入10%的醋酸溶液搅拌至充分溶解;再称量2 g阿拉伯胶于烧杯中,加入40 ℃的纯水稀释使其完全溶解。准确称取0.5 g百里香酚,倒入阿拉伯胶溶液中,不断搅拌直至初乳形成。取上述阿拉伯胶和百里香酚乳剂置于烧杯中,加入壳聚糖溶液混合均匀后水浴加热。用10%的氢氧化钠,调节pH至4.0,显微镜下观察是否有百里香酚微囊生成。搅拌5 min,加入适量50%的戊二醛,再用10%氢氧化钠调节pH至7.0,继续搅拌0.5 h。微囊静置过夜,弃去上清液,抽滤,并用纯水洗涤至微囊表面无戊二醇气味,在40 ℃烘箱中干燥16 h,得到百里香酚微囊,称量后计算收率和包封率。

1.3.2 微囊中百里香酚的包封率及收率的测定

分别取3 mg、3.5 mg、4 mg、4.5 mg、5 mg百里香酚置于100 mL容量瓶,定容至刻度线并摇匀,测定吸光度,计算百里香酚的含量。因壳聚糖和阿拉伯胶均不溶于乙醇,也不溶于水,可通过测定微囊样品上清液中百里香酚的含量,得到微囊的包封率[14,15]。

1.3.3 单因素试验优化百里香酚微囊的制备工艺

以包封率为评价指标,壳聚糖和阿拉伯胶为囊材[16],百里香酚为囊芯,戊二醛为固化剂,选择芯壁比、壁材比和壁材浓度三个因素,进行单因素试验。

1.3.3.1 最佳芯壁比

分别添加0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g百里香酚(芯壁比为3∶25、7∶50、4∶25、9∶50、1∶5)、进行试验,并计算包封率,选择最优的芯壁比进行下一个单因素试验。

1.3.3.2 最佳壁材比

根据1.3.3.1所得最佳芯壁比,以壳聚糖和阿拉伯胶的比例为4∶21、9∶41、1∶4、11∶39、6∶19进行试验,计算包封率,选择最优的壁材比进行下一个单因素实试验。

1.3.3.3 最佳壁材浓度

根据1.3.3.1和1.3.3.2所得最佳芯壁比、壁材比使用量,以壁材的浓度为0.0125 g/mL、0.0139 g/mL、0.0156 g/mL、0.0179 g/mL、0.0208 g/mL进行试验,计算包封率,选择最优的壁材浓度。

1.3.4 正交试验优化百里香酚微囊的制备工艺

以包封率为评价标准,通过单因素试验筛选出最优的芯壁比、壁材比、壁材浓度,设计三因素三水平的正交试验,并对百里香酚微囊正交试验结果进行综合评价,从而得出制备百里香酚微囊的最佳工艺条件。百里香酚微囊正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 百里香酚微囊最佳制备工艺的验证试验

对1.3.4正交试验所得最优工艺参数进行三组平行试验,对结果进行验证。

1.3.6 百里香酚微囊的质量评价

1.3.6.1 百里香酚微囊的溶出度评价

根据《中华人民共和国药典》中测量溶出度的方法[17],量取9 mL浓盐酸置于含有纯水的烧杯中,边到浓盐酸边搅拌,并加水至1000 mL,将稀盐酸超声脱气0.5 h,倒于溶出度测定仪中,相同方法配制5份稀盐酸备用。分别称取1 g百里香酚微囊两份、0.3935 g百里香酚、芯材和壁材物理混合物(0.5664 g壳聚糖、1.7946 g阿拉伯胶、0.3935 g百里香酚),对应地置于2、3、4、5号稀盐酸溶液中,1号稀盐酸溶液设为空白对照。溶出度测定仪温度为37 ℃,转速为100 r/min。分别测定其在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min、135 min时的吸光度。

式中:An-不同时间点溶液对应的吸光度;

A-加入总药物的吸光度;

V-溶出介质的总体积;

V1-各时间点所取溶液的体积。

1.3.6.2 百里香酚微囊的形态分布评价

分别取少量百里香酚微囊、阿拉伯胶、壳聚糖、百里香酚、芯材和壁材混合物置于光学显微镜下观察各组的形态,判断是否有微囊形成。

2 结果与分析

2.1 百里香酚标准曲线的确定

对百里香酚在波长为200～400 nm的范围进行扫描,紫外光谱图如图1所示,百里香酚原料药的最大吸收波长均为274 nm。通过紫外测得各浓度的吸光度分别是0.394、0.440、0.528、0.591、0.646,得到回归方程:y=0.0131x-0.0042(相关系数R2=0.9918),如图2所示,说明百里香酚在30～50 μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。

图1 百里香酚的紫外吸收波长图

2.2 百里香酚微囊的单因素试验结果

2.2.1 芯壁比对百里香酚微囊的影响

因素A是芯壁比、因素B是壁材比、因素C是壁材浓度,固定搅拌速度为450 r/min、温度为40 ℃、固化剂用量为1 mL、壁材比为1∶4、壁材浓度为0.0156 g/mL,芯壁比为3∶25、7∶50、4∶25、9∶50、1∶5进行试验。结果如表2所示,在该芯壁比范围内,包封率随着芯材量的增加而提高,百里香酚为0.5 g时包封率最高,故芯壁比选择1∶5。

2.2.2 壁材比对百里香酚微囊的影响

芯壁比为1∶5、壁材比分别为4∶21、9∶41、1∶4、11∶39、6∶19进行试验。结果如表3所示,在此范围内,随着壁材比的增加包封率、收率也随之增加,当壁材比为6∶19时包封率和收率又降低,可能由于乳剂的黏度太高使得囊壳的结构不稳定,易被破坏,故最佳壁材比是11∶39。

表3 壁材比对百里香酚微囊的影响

2.2.3 壁材浓度对百里香酚微囊的影响

芯壁比为1∶5、壁材比为11∶39,壁材浓度分别为0.0125 g/mL、0.0139 g/mL、0.0156 g/mL、0.0179 g/mL、0.0208 g/mL进行试验,结果如表4所示,最佳壁材浓度为0.0208 g/mL。

2.3 百里香酚微囊的正交试验结果

因素A是芯壁比(A1:1∶5,A2:9∶50,A3:4∶25,)、因素B是壁材比(B1:1∶4,B2:11∶39,B3:6∶19)、因素C是壁材浓度(C1:0.0208 g/mL,C2:0.0179 g/mL,C3:0.0156 g/mL),以综合评价为指标可得出各个因素下的k值大小,表5的试验结果表明,因素A的最大k值是k1(98.47)、因素B的最大k值是k2(99.36)、因素C的最大k值是k1(98.68),通过极差可知,对微囊的综合评价影响最大的是因素B,影响最小的是因素C。方差分析结果如表6所示,因素A的P值是0.057954、因素B的P值是0.059238、因素C的P值是0.102978,因素A和因素B的P值都大于0.05且小于0.1,故百里香酚的投药量、百里香酚与阿拉伯胶和壳聚糖的投药比对百里香酚微囊的包封率有一定的影响,但是壁材的浓度对百里香酚微囊的包封率无影响。通过正交试验和方差分析综合考虑,认为制备百里香酚微囊的最佳条件为芯壁比1∶5、壁材比11∶39、壁材浓度0.0208 g/mL。

表5 百里香酚微囊制备的正交试验结果

表6 百里香酚微囊的方差分析

2.4 百里香酚微囊的验证试验结果

以最优工艺A1B2C1为条件进行验证性试验,即平行制作三组样品,进行三次重复试验,对样品的产率、包埋率与综合评分进行统计。结果如表7所示,最佳工艺参数为芯壁比1∶5,壁材比11∶39,壁材浓度0.0208 g/mL,搅拌速度450 r/min,温度40 ℃,50%戊二醛1 mL。

表7 百里香酚微囊的验证试验结果

2.5 百里香酚微囊的质量评价

2.5.1 百里香酚微囊的溶出度评价

如表8结果所示,百里香酚、百里香酚微囊、芯材和壁材混合物的累积溶出度随着时间的延长而增加,但百里香酚、芯材和壁材混合物的累积溶出度都高于百里香酚微囊。因此,百里香酚微囊可以有效减小百里香酚的溶出、减缓释药速度、延长药效时间。

表8 百里香酚的溶出度测定结果

2.5.2 百里香酚微囊的形态分布评价

将百里香酚微囊与阿拉伯胶、壳聚糖、芯材和壁材混合物、百里香酚进行形态对比(图3-图8),可发现并确定有新的物质生成。如图8所示,可观察到百里香酚微囊的表面光滑、呈球状。

图3 壳聚糖的显微镜观察结果

图4 阿拉伯胶的显微镜观察结果

图5 百里香酚的显微镜观察结果

图6 芯材和壁材混合物的显微镜观察结果

图7 百里香酚微囊样品1的显微镜观察结果

图8 百里香酚微囊样品2的显微镜观察结果

3 结论

本试验以包封率和收率为评价指标,通过百里香酚的特殊微囊包被处理技术,以阿拉伯胶和壳聚糖为壁材、50 %戊二醛为固化剂,在40 ℃、450 r/min的条件下采用单因素试验与正交试验相结合的方法,筛选出百里香酚微囊最佳的制备工艺为百里香酚与壁材比1∶5、壳聚糖与阿拉伯胶比11∶39、壁材浓度0.0208 g/mL。显微镜下观察可见,百里香酚被成功包被,即形成百里香酚微囊。溶出度实验表明,将药物微囊化可以减缓药物的释放速度、延长药效时间。本试验数据对于植物精油微囊制剂应用于畜禽疾病防控领域具有重要的现实意义。