免疫层析试纸条在食品安全检测中的应用

舒友琴,魏 荣

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院,河南 郑州 450046)

免疫层析试纸条检测技术融合免疫技术和层析技术于一体,具备层析技术的优越分离能力和抗原-抗体免疫反应的高特异性,具有检测快速、制作简单、成本低等优点,目前,该法已广泛应用于食品安全检测领域。在应用初期,免疫层析试纸条技术只能检测单一的目标物,且检测灵敏度较低。经过不断探索,已开发出具备多重检测能力和以新型纳米标记物为探针的试纸条,免疫层析检测技术变得极为灵敏高效。

1 免疫层析试纸条的原理

常规的免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、吸水垫及硝酸纤维素膜等四个基本部分组成,试纸条将这四个部分相互重叠粘贴于聚氯乙烯底板上(图1),其中硝酸纤维素膜上固化两条线即检测线(T线)和质控线(C线)。免疫层析试纸条检测技术分为竞争法和夹心法[1]。

图1 试纸条结构示意图

1.1 竞争免疫层析法

竞争免疫层析法主要用于检测抗原位点较少或仅具有单个抗原位点的小分子化合物。此种方法是在结合垫上喷洒含有标记物的抗体,T线处包被捕获抗原,C线处包被二抗。检测时在样品垫上滴入待测样品,如果待测样品含有目标抗原,那么目标抗原会在毛细作用力下沿着层析方向先与结合垫上的标记抗体结合,形成免疫复合物,不会再与T线处的捕获抗原结合,T线就无色,而未与捕获抗原结合的标记抗体会与二抗结合使C线显色,此时检测结果为阳性。相反,如果不含有目标抗原,则标记抗体会与T线和C线处的包被物质结合,此时T线和C线均显色,检测结果为阴性。若C线不显色,则说明试纸条失效。

1.2 夹心免疫层析法

1.2.1 双抗体夹心免疫层析法

双抗体夹心免疫层析法用于检测含有多个结合位点的大分子抗原。此种方法是在结合垫上喷洒被标记物标记的抗体,T线固定与目标抗原和另一抗原表位结合捕获抗原,C线处包被二抗。检测时,如果样品中含有目标抗原,那么目标抗原会在层析作用下先与标记抗体结合形成复合物,之后又与捕获抗体结合形成双抗体夹心结构,从而T线显色。未能与捕获抗原结合的标记抗体会被C线抗体拦截并结合显色,此时样品检测结果为阳性。如果样品中不含有目标抗原,则只有C线显色,样品检测结果为阴性。若C线不显色,说明试纸条失效。

1.2.2 双抗原夹心免疫层析法

双抗原夹心免疫层析法用于检测含有多个结合位点的大分子抗体,与双抗体夹心免疫层析法类似,此种方法是在结合垫上喷洒标记抗原,T线固定二抗作为捕获抗体,C线固定识别抗原的特异性单抗或多抗。结合垫中的标记抗原首先与样品中的目标抗体结合形成复合物,流动到T线时,复合物会与捕获抗原结合显色。未结合的标记抗原会被C线拦截并聚集显色。阳性样品的检测结果为T线和C线同时显色,而阴性样品的检测结果只有C线显色。

2 免疫层析试纸条的标记探针

传统试纸条采用胶体金标记技术,判读简单,但不能够满足对更高检测灵敏度的需求。科研工作者开发了更多基于标记探针的免疫层析试纸条,标记探针变得多样化。表1是对试纸条标记探针的简单介绍[2-8]。

表1 免疫层析试纸条的标记探针

3 免疫层析试纸条检测技术在食品安全检测中的应用

3.1 农药残留检测

目前,我国残留比较严重的农药主要是氨基甲酸酯类农药和有机磷农药。朱亮亮等[9]研发胶体金免疫层析试纸条,检测蔬菜和水果中的有机磷农药,对辛硫磷、对硫磷、丙溴磷和氯唑磷等有机磷农药的检测限均为200 μg/kg,检测时间仅为15 min,对大批量样本检测具有实际意义。吕俊海等[10]建立了一种基于荧光微球免疫层析的检测试纸卡,实现了对农药醚菊酯的定量检测,检测限为1.057 ng/mL,定量限为1.890 ng/mL。

3.2 兽药残留检测

畜产品中残留的兽药种类主要是激素类、抗生素类和抗菌类。激素类药物具有引起人体内分泌紊乱和性早熟等危害,主要的激素类药物有克伦特罗(俗名“瘦肉精”)、雌二醇和雌三醇等。试纸条技术在激素类药物残留检测中的应用如表2所示。

表2 免疫层析试纸条在激素类兽药残留检测中的应用

β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、喹诺酮类等是畜产品中残留的主要抗生素种类。免疫层析试纸条在这些抗生素类兽药检测的应用如表3所示。

表3 免疫层析试纸条在抗生素类兽药残留检测中的应用

抗菌类兽药残留主要是孔雀石绿和硝基呋喃类药物。孙虹等[21]开发了一种在超顺磁性纳米微球上偶联孔雀石绿单克隆抗体探针的免疫层析试纸条,定性灵敏度为1 μg/mL,定量灵敏度为0.60 ng/mL,对无色孔雀石绿无交叉反应,可适用于现场快速检测鱼肉或水体中的孔雀石绿。

免疫层析试纸条可用于饲料样本中硝基呋喃类药物的快速检测和现场筛查,在检测硝基呋喃类药物中的应用如表4所示。

表4 免疫层析试纸条在硝基呋喃类兽药残留检测中的应用

3.3 重金属检测

重工业的发展导致了“三废”污染,人体摄入受到重金属污染的食品后,重金属会在人体内蓄积,危害人体健康,如铅超标会诱发贫血且损伤神经系统,汞超标会导致严重肝肾损伤,还会导致血尿,孕妇体内砷超标有可能导致胎儿畸形。目前,免疫层析试纸条在重金属检测中的应用如表5所示。

表5 免疫层析试纸条在重金属检测中的应用

3.4 食品添加剂检测

合理使用食品添加剂可改善食品品质,但滥用食品添加剂会危害人体健康。比较常用的食品添加剂有增味剂谷氨酸钠、肉类发色剂亚硝酸盐、漂白剂二氧化硫、防腐剂苯甲酸钠等。刘凤银等[27]开发了用于快速检测食品中亚硝酸盐含量的免疫层析试纸条,检测限为1 mg/kg,检测范围为1-70 mg/kg,该免疫层析试纸条可用于肉制品、蔬菜制品中亚硝酸盐残留量的检测。

3.5 违禁食品添加物质的检测

三聚氰胺事件发生以后,国家公布了食品中可能违法添加的非食用物质名单,其中包括苏丹红、三聚氰胺、罗丹明B等。苏丹红是一种化学染色剂,不属于食品添加剂,人在食用后会诱发癌症。人体摄入过量三聚氰胺可能会产生结石,婴幼儿饮用了高浓度三聚氰胺污染的奶粉后,会导致泌尿系统出现问题。罗丹明B是人工合成的化工染料,往往被非法用作辣椒粉、辣椒油等调味品的染色剂,食用后会致癌致突变。表6是试纸条技术在违禁食品添加物质检测中的应用。

表6 免疫层析试纸条在违禁食品添加物检测中的应用

3.6 生物毒素的检测

生物毒素是由动物、植物和微生物等产生的有毒物质,包括贝类毒素、微囊藻毒素和真菌毒素等。真菌毒素广泛存在于农产品类食品中,常见的与食品有关的真菌毒素有伏马毒素、赭曲霉毒素、黄曲霉毒素和玉米赤霉毒素等。由生物毒素引起的食品安全事件时有发生,如食用黄曲霉毒素超标的食物和食用含有蘑菇毒素的野生蘑菇导致的中毒事件。目前免疫层析试纸条在生物毒素检测方面已经取得了较大进展,如表7所示。

表7 免疫层析试纸条在生物毒素检测方面的应用

3.7 食源性致病菌的检测

食源性致病菌是通过食物传播疾病的细菌。沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌等是较为常见的食源性致病菌。食用被致病菌感染的食物除了引起消化道症状外,还引起严重的并发症。致病微生物引起的食源性疾病是我国食品安全的重大隐患,免疫层析试纸条在此类检测中的相关应用如表8所示。

表8 免疫层析试纸条在食源性致病菌检测方面的应用

3.8 人畜共患病的检测

布鲁氏菌病、口蹄疫、结核病等是常见的人畜共患病。生物素和地高辛被用作核酸探针,具有敏感和特异性的特点,龚真莉等[40]将其用于引物中,使扩增产物与探针结合,从而建立了一种基于核酸探针的试纸条,用于检测口蹄疫病毒,所建立的核酸试纸条可以检测到0.3×10-3-3×10-3μg/μL的RT-PCR产物,为口蹄疫病毒检测提供了一种新的方法。郭建等[41]研制了快速检测血清抗体的免疫层析试纸条,用于检测动物的布鲁菌病和结核病,特异性好,准确率高,检测结果与现有的检测方法高度符合。

免疫层析试纸条检测快速、即时,已经朝着高灵敏度和定量化方向发展。与传统技术相比,基于标记探针的试纸条技术具有更加优良的性能,能够快速实现多靶标同时检测。可以预见,随着数字技术、智能技术的迅猛发展,更加便捷的智能化试纸条会更加广泛地用于食品安全检测领域,免疫层析试纸条技术应用前景巨大。