lncRNA TTN-AS1调控miR-134-5p/MBTD1信号轴促进骨肉瘤的生长和转移*

刘汉涛，秦宏敏，赵良虎

攀枝花学院附属医院骨科，四川攀枝花 617000

骨肉瘤是一类多发生于儿童、青少年的原发性骨恶性肿瘤，转移性或复发性的骨肉瘤患者5年生存率低于30%，目前骨肉瘤的治疗方式包括手术治疗和化疗等，但是手术后复发或化疗耐药一直威胁着患者的健康，所以寻找新型的骨肉瘤治疗方法尤为重要[1-2]。长链非编码 RNA(lncRNA)是一类长度大于200 nt的非编码 RNA，可通过表观遗传学、转录及转录后水平影响基因表达和翻译，进而参与调控肿瘤生长[3-4]。其中TTN-AS1已经被证实是在多种肿瘤中发挥调控作用的一种lncRNA，过表达的TTN-AS1与乳腺癌、肺癌、消化系统肿瘤、生殖系统肿瘤患者的不良预后相关[5]。本文通过探究TTN-AS1在骨肉瘤中的表达及其对骨肉瘤细胞生长和转移的影响与相关机制，旨在为骨肉瘤的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料来源 人成骨细胞hFoB1.19和人骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2购自中国科学院上海细胞库。

1.2仪器与试剂 反转录试剂盒为日本TaKaRa公司产品；PowerUpTMSYBR®Green Master Mix 试剂盒、Lipofectamine 2000试剂盒和Trizol试剂盒为美国Invitrogen公司产品；细胞计数试剂盒(CCK8法)为沈阳万类生物技术有限公司产品；双荧光素酶报告基因试剂盒为美国Promega公司产品。含MBT结构域蛋白1(MBTD1)质粒、TTN-AS1小干扰RNA(siRNA)、TTN-AS1 siRNA 阴性对照、微小RNA(miR)-134-5p inhibitor为上海吉玛制药技术有限公司产品。miR-134-5p、TTN-AS1、MBTD1、GADPH、U6引物序列由苏州吉玛基因股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1细胞培养 取液氮保存的hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2细胞，迅速解冻后1 000 r/min离心5 min，细胞沉淀溶解于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，隔天更换培养基，细胞培养至汇合度达80%时进行细胞传代。

1.3.2细胞分组与转染 对hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2细胞中TTN-AS1的表达水平进行检测，选择表达水平最高的SAOS2细胞进行后续研究。将SAOS2细胞分为Control组(未转染)、si-NC组(转染TTN-AS1 siRNA 阴性对照)、si-TTN-AS1组(转染TTN-AS1 siRNA)、si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor组(共转染TTN-AS1 siRNA和miR-134-5p inhibitor)、si-TTN-AS1+MBTD1组(共转染TTN-AS1 siRNA和MBTD1质粒)，按照上述分组使用Lipofectamine 2000试剂盒进行转染。主要步骤：转染前1 d采用6孔板接种5×105个SAOS2细胞，将1 μg/50 μL的A液[TTN-AS1 siRNA 阴性对照或TTN-AS1 siRNA或miR-134-5p inhibitor或MBTD1质粒(不含血清Opti-MEM培养基)]与1 μg/50 μL的B液[Lipofectamine 2000试剂(不含血清Opti-MEM培养基)]混匀，室温放置20 min，将培养基更换为无血清的DMEM培养基，按实验分组分别加入相应的混合液，37 ℃孵育6 h，再换成含10%FBS的DMEM培养基培养24 h。

1.3.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-134-5p、MBTD1 mRNA与TTN-AS1表达水平 采用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA，核酸定量后将RNA稀释为1 μg/μL，使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，反应体系：RNA 2 μL，Oligo(dT) Primer 1.5 μL，Random 6 mers 1.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1.5 μL，5×PrimeScript Buffer 6 μL，RNase-free dH2O 7.5 μL；反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存反应产物。所得cDNA使用qRT-PCR试剂盒检测miR-134-5p、MBTD1 mRNA与TTN-AS1表达水平，反应体系：PowerUpTMSYBR®Green Master Mix(2×)10 μL,上游引物0.6 μL,下游引物0.6 μL,DNA模板1 μL,RNase-free dH2O 7.8 μL；反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40个循环,无最后延伸。引物序列：TTN-AS1上游引物5′-CCAGACACCTAACCAACTTCC-3′，下游引物5′-GTGATCTCATCCCTCTTGCTT-3′；MBTD1上游引物5′-CTACAGCCTCCAGCATCACA-3′，下游引物5′-CTCATCAGCTGACCC AGACA-3′；GADPH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物5′-TGGTGAAG ACGCCAGTGGA-3′；miR-134-5p上游引物5′-CTCAACAACCTTGGCTGACCG-3′，下游引物5′-ACACTATGTGTCGAAGCTT-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采集荧光信号Ct值,以GAPDH或U6作为内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。

1.3.4双荧光素酶报告基因实验 采用StarBase数据库预测TTN-AS1和miR-134-5p的结合位点，TargetScan数据库预测MBTD1和miR-134-5p的结合位点，使用Lipofectamine 2000试剂盒将含TTN-AS1 WT、TTN-AS1 MUT、MBTD1 WT、MBTD1 MUT荧光素酶载体转染至SAOS2细胞，然后再分别将miR-NC和miR-134-5p mimic转染至上述转染的SAOS2细胞(miR-NC+TTN-AS1 WT组、miR-NC+TTN-AS1 MUT组、miR-134-5p mimic+TTN-AS1 WT组、miR-134-5p mimic+TTN-AS1 MUT组、miR-NC+MBTD1 WT组、miR-NC+MBTD1 MUT组、miR-134-5p mimic+MBTD1 WT组、miR-134-5p mimic+MBTD1 MUT组)。转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组细胞相对荧光强度。

1.3.5CCK8法检测细胞增殖 将各组细胞按照每孔5×103个接种于96孔板中，每组5个复孔，设置培养24、48、72 h的细胞培养板，在对应的时间点取出96孔板，每孔加入10 μL 5 mg/mL的CCK8溶液，在37 ℃培养箱中孵育4 h后用酶标仪检测450 nm处每孔的吸光度(A)值。

1.3.6Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭 将各组细胞用不含血清的DMEM溶液重悬后，以1×104个/孔的浓度接种于Transwell上室(或以1×104个/孔的浓度接种于铺有50 μL Matrigel胶的Transwell上室用于检测细胞侵袭能力)，小室置于含DMEM培养基(含10%FBS)的24孔板中，小室底部浸于培养基中，72 h后取出小室，用棉签擦除上室中未穿过的细胞，小室底部用多聚甲醛固定10 min，然后用结晶紫染色10 min，清洗晾干后于显微镜下观察拍照，使用Image J软件统计细胞迁移或侵袭数。

2 结 果

2.1TTN-AS1在人成骨细胞及骨肉瘤细胞中的表达水平 与人成骨细胞hFoB1.19比较，骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2中TTN-AS1表达水平明显上调(P<0.05)，其中SAOS2细胞中TTN-AS1表达水平最高，因此选择SAOS2细胞进行后续研究，见图1。

注：与hFoB1.19细胞比较，*P<0.05。图1 TTN-AS1在hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2细胞中的表达水平

2.2TTN-AS1靶向调控miR-134-5p StarBase数据库预测TTN-AS1和miR-134-5p的结合位点如图2A所示。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR-NC+TTN-AS1 WT组比较，miR-134-5p mimic+TTN-AS1 WT组的SAOS2细胞相对荧光强度明显下调(P<0.05)，而miR-NC+TTN-AS1 MUT组的SAOS2细胞相对荧光强度与miR-134-5p mimic+TTN-AS1 MUT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2B。qRT-PCR检测结果显示，si-TTN-AS1组SAOS2细胞miR-134-5p表达水平明显高于si-NC组(P<0.05)，见图2C。

2.3miR-134-5p靶向调控MBTD1 TargetScan数据库预测MBTD1和miR-134-5p的结合位点如图3A所示。双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR-NC+MBTD1 WT组比较，miR-134-5p mimic+MBTD1 WT组的SAOS2细胞相对荧光强度明显下调(P<0.05)，而miR-134-5p mimic+MBTD1 MUT组和miR-NC+MBTD1 MUT组的SAOS2细胞相对荧光强度比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3B。

注：A为StarBase数据库预测TTN-AS1和miR-134-5p的结合位点；B为双荧光素酶报告基因实验验证TTN-AS1与miR-134-5p的靶向关系，与miR-NC+TTN-AS1 WT组比较，*P<0.05；C为qRT-PCR检测TTN-AS1对miR-134-5p表达的影响，与si-NC组比较，#P<0.05。图2 TTN-AS1靶向调控miR-134-5p

2.4TTN-AS1通过调控miR-134-5p/MBTD1信号轴调控骨肉瘤细胞的增殖 Control组与si-NC组细胞MBTD1 mRNA表达水平及增殖能力(即培养24、48、72 h时细胞的A值)差异无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组比较，si-TTN-AS1组细胞MBTD1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)，细胞增殖能力明显下降(P<0.05)；与si-TTN-AS1组比较，si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor组和si-TTN-AS1+MBTD1组细胞MBTD1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，细胞增殖能力明显增强(P<0.05)，见图4。

2.5TTN-AS1通过调控miR-134-5p/MBTD1信号轴调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭 Control组与si-NC组细胞迁移和侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组比较，si-TTN-AS1组细胞迁移和侵袭能力明显下降(P<0.05)；与si-TTN-AS1组比较，si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor组和si-TTN-AS1+MBTD1组细胞迁移和侵袭能力明显增强(P<0.05)，见图5。

注：A为TargetScan数据库预测MBTD1和miR-134-5p的结合位点；B为双荧光素酶报告基因实验验证MBTD1和miR-134-5p的靶向关系，与miR-NC+MBTD1 WT组比较，*P<0.05。图3 miR-134-5p靶向调控MBTD1

注：A为qRT-PCR检测各组细胞MBTD1 mRNA表达水平；B为CCK8法检测各组细胞增殖能力；与si-NC组比较，*P<0.05；与si-TTN-AS1组比较，#P<0.05。图4 TTN-AS1通过调控miR-134-5p/MBTD1信号轴调控骨肉瘤细胞的增殖

注：A为Transwell小室法检测各组细胞迁移和侵袭能力镜下图(×20)；B为Transwell小室法检测各组细胞迁移和侵袭数；与si-NC组比较，*P<0.05；与si-TTN-AS1组比较，#P<0.05。图5 TTN-AS1通过调控miR-134-5p/MBTD1信号轴调控骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

3 讨 论

随着基因测序和基因芯片技术的发展，越来越多的lncRNA被发现可调控肿瘤的发生、发展以及与患者的预后相关，也有研究指出，lncRNA有望成为肿瘤治疗的新靶点[6-7]。骨肉瘤是一种原发性骨恶性肿瘤，肿瘤的迅速增殖以及转移是影响骨肉瘤预后的重要因素，虽然随着手术和放化疗等治疗方式的联合使用，骨肉瘤患者的生存时间显著延长，但是耐药、复发、转移等仍严重影响着患者的临床治疗效果。研究表明，多种lncRNA均可调控骨肉瘤的病理进程，例如SNHG4通过靶向调控miR-224-3p促进骨肉瘤的生长并且与患者的不良预后相关[8]，其也可通过调控miR-377-3p的表达而促进骨肉瘤的增殖和迁移[9]；SARCC可调控miR-143/己糖激酶2信号轴而影响骨肉瘤对顺铂的敏感性[10]；DANCR可靶向调控miR-149/MSI2轴而促进骨肉瘤的迁移和侵袭能力[11]。有研究亦发现多种lncRNA具有抑制骨肉瘤的功能，例如TMPO-AS1可靶向调控miR-329和E2F1基因而促进骨肉瘤细胞的凋亡[12]；TUSC7可通过miR-181a/RASSF6轴抑制骨肉瘤的进展[13]。所以，lncRNA被认为具有作为肿瘤治疗靶点的潜力。

TTN-AS1已经被发现在多种肿瘤中发挥重要的调控作用。有研究指出，TTN-AS1可通过调控miR-376a-3p而促进子宫内膜癌的病理进程[14]；TTN-AS1也可通过靶向调控miR-27b-3p/RUNX1轴而促进胶质瘤的病理进程[15]；其亦可通过调控miR-15b-5p/FBXW7轴而促进卵巢癌的生长和转移[16]。但是目前关于TTN-AS1在骨肉瘤中的表达研究较少，本研究发现，TTN-AS1在骨肉瘤细胞U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2中的表达水平明显高于在人成骨细胞hFoB1.19中的表达水平，推测TTN-AS1具有调控骨肉瘤细胞生长和转移的功能。本研究在TTN-AS1表达水平最高的SAOS2细胞中转染TTN-AS1 siRNA抑制TTN-AS1表达后，SAOS2细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著降低，说明抑制TTN-AS1表达可抑制骨肉瘤细胞的生长和转移。lncRNA的重要调控机制为抑制miRNA表达而影响其靶基因的表达，在肿瘤的病理进程中，lncRNA会携带其miRNA的“种子序列”，像海绵一样结合于miRNA，进而抑制miRNA与mRNA的结合[17-18]。本文通过生物信息学预测TTN-AS1和miR-134-5p的结合位点，并且通过双荧光素酶报告基因实验证明miR-134-5p为TTN-AS1的靶基因。miR-134-5p亦在多种肿瘤中发挥调控作用，例如miR-134-5p靶向DAB2促进Ⅰ期肺腺癌的转移和化疗耐药[19]。也有研究表明，miR-134-5p可被多种lncRNA调控而影响肿瘤的病理进程，例如LINC01278通过调控miR-134-5p/KDM2A轴而加速肠癌的病理进程[20]，LINC00858通过调控miR-134-5p/RAD18信号通路而加重卵巢癌细胞的癌症表型[21]。本研究发现，抑制TTN-AS1可促进SAOS2细胞miR-134-5p的表达。共转染TTN-AS1 siRNA和miR-134-5p inhibitor后的SAOS2细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显强于转染TTN-AS1 siRNA的SAOS2细胞，说明TTN-AS1可通过调控miR-134-5p的表达水平而影响骨肉瘤细胞的生长和转移。

miRNA发挥调控作用的机制为结合于其靶基因mRNA的3′非翻译区而抑制靶基因的蛋白质翻译[22]。本文通过TargetScan数据库预测miR-134-5p与MBTD1的结合位点，双荧光素酶报告基因实验验证了MBTD1为miR-134-5p的靶基因。MBTD1是与肿瘤发生相关的多克隆蛋白家族成员[23-24]，研究表明，过表达MBTD1与前列腺癌的不良预后相关[25]；HAN等[26]发现，在子宫内膜间质肉瘤中存在的MBTD1-PHF1基因融合与疾病的发生密切相关。

综上所述，lncRNA TTN-AS1在骨肉瘤中高表达，抑制其表达可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与TTN-AS1调控miR-134-5p/MBTD1信号轴有关，但本研究仅为体外研究，体内研究是否会得到相同的结果尚需深入探讨，特别是TTN-AS1能否作为骨肉瘤诊断标志物或治疗靶点还需进一步研究。