不同核酸提取及扩增系统组合检测新型冠状病毒核酸的效能比较*

李卓敏，张昕雨，于 洋，张 磊，王新宇，杜金龙，王志阳，谭延国△

1.首都医科大学附属复兴医院检验科，北京 100038;2.首都医科大学医学检验学系，北京 100038

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情在我国仍在持续，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RNA检测仍是常态化疫情防控的首选手段，且为疑似病例诊断的“金标准”[1]。随着经验的积累和技术的进步，采用荧光定量PCR检测SARS-CoV-2 RNA时单次实验的阳性检出率已从30%～50%提升至88%[2-3]，但如何进一步提高检测质量和效能，仍是抗疫工作面临的重要问题之一。国务院印发的《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》规定，各医疗机构应选用核酸扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂及扩增设备等，并对各检测系统进行必要的性能验证[4]。目前，核酸提取试剂及设备多为配套系统，但不同的扩增试剂及扩增设备多为搭配使用。首都医科大学附属复兴医院检验科实验室所使用的不同核酸提取设备和试剂、核酸扩增设备和试剂构成了多个检测系统，本研究通过回顾性分析阴性标本内标基因(IC基因)以及弱阳性质控品N、O、IC基因的Ct值，试图进一步评估不同核酸提取及扩增系统组合使用对SARS-CoV-2 RNA检测效能的影响。

1 材料与方法

1.1人源性标本 所有IC基因的Ct值均收集自2021年12月在首都医科大学附属复兴医院SARS-CoV-2核酸检测实验室检测SARS-CoV-2 RNA为阴性的受检者的标本，共3 496份，均为单管采集的口咽拭子标本。

1.2仪器与试剂

1.2.1提取系统 均为全自动磁珠法，分别为32通道的Smart32核酸提取仪及配套试剂盒(检测总耗时32 min，购自中山大学达安基因股份有限公司，以下称为提取系统a)，96通道的Autra9600核酸提取仪及配套试剂盒(检测总耗时17 min，购自上海之江生物科技股份有限公司，以下称为提取系统b)，96通道的MagNA Pure 96核酸提取仪及配套试剂盒[检测总耗时58 min，购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，以下称为提取系统c]。

1.2.2扩增系统 扩增系统为购自不同厂商的3种荧光定量PCR仪，分别为SLAN-96S(购自上海宏石医疗科技有限公司，以下称为扩增系统1)、安杰思AFD9600(购自杭州安杰思生物科技有限公司，以下称为扩增系统2)及LightCycler®480[购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，以下称为扩增系统3]。

1.2.3扩增试剂 SARS-CoV-2 RNA检测试剂购自中山大学达安基因股份有限公司(批号：2021391),该试剂同时扩增的靶基因为O、N和IC基因。检测下限为500 copies/mL，Ct值≤30判定为阳性。

1.2.4室内质控品 广州邦德盛生物科技有限公司提供的SARS-CoV-2液体质控品，选取S1浓度，靶值为1.6×103。

1.3方法 使用不同提取及扩增系统组合进行检测，实验操作过程均严格按照仪器、试剂说明书的相关要求。每92份标本为一个检测批次，每个批次均设置2个盐水对照、1个阴性质控及1个弱阳性质控，并全程参与核酸提取及扩增。在实验有效的前提下，数据方可纳入本研究。实验有效性的判定：弱阳性质控O、N及IC基因(CY5<30)均为阳性，盐水对照的O、N、IC基因均为阴性，阴性质控的IC基因为阳性。

2 结 果

2.1不同提取、扩增系统组合检测人源性标本IC基因的Ct值结果 不同提取系统提取的核酸在同一扩增系统上扩增、同一提取系统提取的核酸在不同扩增系统上扩增检测人源性标本IC基因的Ct值具体见表1。

2.1.1同一提取系统提取的核酸由不同扩增系统扩增的结果比较 提取系统a提取的核酸在扩增系统1、2、3上分别扩增，其IC基因的Ct值差异有统计学意义(P=0.003),且任意两种扩增系统之间IC基因的Ct值比较差异也有统计学意义(扩增系统1与2之间比较P=0.029，2与3之间比较P<0.001，1与3之间比较P=0.017)。提取系统b提取的核酸在扩增系统1和3上扩增，其IC基因的Ct比较差异有统计学意义(P=0.026)。提取系统c提取的核酸在扩增系统2和3上扩增，其IC基因的Ct值差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

2.1.2不同提取系统提取的核酸在同一扩增系统上扩增的结果比较 提取系统a、b、c提取的核酸在扩增系统3上扩增，其IC基因的Ct值差异有统计学意义(P=0.017),且任意两种提取系统间差异也均有统计学意义(提取系统a与b之间比较P=0.034，b与c之间比较P<0.001，a与c之间比较P<0.001)；提取系统a、c提取的核酸在扩增系统2上扩增，其IC基因的Ct值差异有统计学意义(P<0.001)；提取系统a、b提取的核酸在扩增系统1上扩增，其IC基因的Ct值差异有统计学意义(P=0.036)。见表1。

2.2不同提取、扩增系统组合检测弱阳性质控品O、N、IC基因Ct值结果 不同提取系统提取的核酸在同一扩增系统上扩增、同一提取系统提取的核酸在不同扩增系统上扩增检测弱阳性质控品的O、N及IC基因Ct值具体见表2～4。

2.2.1N基因检测结果 提取系统a提取的核酸，由扩增系统2、3扩增，其N基因Ct值差异无统计学意义(P=0.911)；提取系统a、b提取的核酸，由扩增系统3扩增，其N基因Ct值差异无统计学意义(P=0.307)；其余不同提取系统提取的核酸在同一扩增系统上扩增，以及同一提取系统提取的核酸在不同扩增系统上扩增，其N基因Ct值差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.2.2O基因检测结果 提取系统a提取的核酸由扩增系统2、3扩增，其O基因Ct值差异无统计学意义(P=0.925)；提取系统a、c提取的核酸由扩增系统2扩增，其O基因Ct值差异无统计学意义(P=0.548)；提取系统b提取的核酸由扩增系统1、3扩增，其O基因Ct值差异无统计学意义(P=0.117)；其余不同提取系统提取的核酸在同一扩增系统上扩增，以及同一提取系统提取的核酸在不同扩增系统上扩增，其O基因Ct值差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 不同提取、扩增系统组合检测人源性标本IC基因的Ct值比较

表2 不同提取、扩增系统组合检测弱阳性质控品N基因Ct值结果比较

表3 不同提取、扩增系统组合检测弱阳性质控品O基因Ct值结果比较

2.2.3IC基因检测结果 提取系统a、c提取的核酸由扩增系统3扩增，其IC基因Ct值差异无统计学意义(P=0.247)；提取系统a、c提取的核酸由扩增系统2扩增，其IC基因Ct值差异无统计学意义(P=0.905)；其余不同提取系统提取的核酸在同一扩增系统上扩增，以及同一提取系统提取的核酸在不同扩增系统上扩增，其IC基因Ct值差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同提取、扩增系统检测弱阳性质控品IC基因Ct值结果比较

3 讨 论

SARS-CoV-2核酸提取和扩增仪器、试剂种类繁多，性能不一[5-8]。本研究所用的不同提取及扩增系统均经过充分的性能验证且通过室间质量评价。在此基础上，本研究尝试进一步探讨不同检测系统组合使用对检测结果的影响。

因阳性标本较难留取，故本研究所纳入的数据采集自阴性标本的IC基因及同一批号弱阳性质控品的靶基因及IC基因,所有数据均来自室内质控在控的实验批次。实践证明，采用人源性内标的扩增试剂可有效监控每个标本的采集质量，以排除因未采集人源性标本而导致的假阴性结果[9]。

本研究仅纳入了单采标本IC基因的Ct值，可避免混采标本因采集过程繁琐和标本来源人数众多所产生的质量不确定性的问题。本研究发现，不同的核酸提取、扩增系统组合用于检测SARS-CoV-2 RNA时结果存在差异，且有提取及扩增系统的最佳配伍组合，如检测人源性标本IC基因时，提取系统c与扩增系统3的组合所检测的Ct值最低，为16.33±1.86，而提取系统a与扩增系统2的组合所检测的Ct值最高，为21.87±1.80。此外，对于室内质控品检测，也存在类似现象，如弱阳性质控品IC基因经提取系统c或a提取后由扩增系统3扩增的组合。本研究显示，最佳的配伍组合可显著提升检测效率，相对于效能最差的组合，其可将弱阳性质控品靶基因的Ct值提高；另外，对于不同提取系统提取的核酸，扩增系统3的扩增效率也显著高于其他两种扩增系统。上述研究结果的临床应用对于提高低病毒载量标本的检出率具有非常重要的意义。

Ct值的高低从一定程度上可反映检测系统的扩增效率，但其值大小也会受实验条件等因素的影响，所以不能单纯把Ct值作为评价试剂好坏的标准，还应结合阳性标本的检出率等综合判定[10-11]。因缺乏SARS-CoV-2 RNA的阳性标本，本研究仅比较了弱阳性室内质控品的各靶基因和IC基因的Ct值检测结果，虽然与人源性标本的基质不同，可能导致结果的偏差，但对不同提取及扩增系统的性能评估仍具有一定的参考价值[12]，因为同一个实验室的环境相对稳定，试剂种类和批号、室内质控品水平和批号等也是相对固定的。如条件允许，应使用阳性标本代替弱阳性室内质控品，进一步对核酸提取系统及扩增系统的性能进行评价。同时因收费标准的下调，以及提取系统b及扩增系统1购买时间较晚，因此在本研究中缺少部分提取系统b搭配扩增系统2以及提取系统a、c搭配扩增系统1的检测数据，此为本研究的不足之处。

为提升SARS-CoV-2 RNA的检测效能，应在性能验证的基础上进一步评估实验室内各种核酸提取和扩增系统的检测效能，以便选择最佳的提取、扩增配伍组合。