健康成年人血清中22种胆汁酸亚组分参考区间的建立*

杜金龙，刘振东，马 佳，刘淑梅，杜海燕，唐春燕，董一红，李卓敏，田 野，谭延国△

1.首都医科大学附属复兴医院检验科，北京100038；2.北京梅斯质谱生物科技有限责任公司，北京102629；3.首都医科大学医学检验系，北京100038

胆汁酸是胆汁的主要成分，由胆固醇代谢产生，在肝脏合成初级胆汁酸，经肠道微生物分解为次级胆汁酸后由小肠重吸收，经门静脉入血回肝，再由肝细胞摄取，少量进入血液循环，形成肝肠循环[1-2]。胆汁酸是敏感的肝细胞损伤诊断指标，也是肠道、胆道病变的评估指标。总胆汁酸早已常规应用于肝胆疾病的诊断，但目前对于胆汁酸亚组分却少有研究。胆汁酸亚组分的水平与比例的改变与胆固醇代谢关系密切，其可影响胆固醇代谢[3-4]。有研究显示，脂肪性肝病、酒精性肝病、原发性肝癌等肝胆疾病患者血清胆汁酸亚组分谱与健康人群有所差异[5-7]。本研究对健康成年人胆汁酸亚组分的水平分布特征和参考区间进行了探讨，以期为肝胆疾病中胆汁酸亚组分变化情况的相关研究及临床应用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集在首都医科大学附属复兴医院健康管理中心体检的250例表观健康成年人为研究对象，其中男155例，女95例；年龄27～96岁，中位年龄62岁。依据美国临床和实验室标准协会(CLSI) C28-A3文件中参考个体的选择要求，研究与年龄相关的参考区间范围应按年龄进行分组，本研究中27～60岁(共124例，其中男88例，女36例)为中青年组，>60岁(共126例，其中男67例，女59例)为老年组。依据CLSI C28-A3文件关于健康者的要求，具有下述任意一项者将被排除在参考人群之外:患有自身免疫性疾病者；吸烟、饮酒、药物滥用者；妊娠期、哺乳期女性；有家族遗传病史者；近期有手术史及因疾病住院治疗者；肝、肾、心、肺功能不全者；收集的血清标本量不足以完成检测或者出现严重溶血或脂血者。

1.2仪器与试剂 Waters ACQUITY UPLC I-Class液相系统/Waters Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪[沃特世科技(上海)有限公司],LC-MS级甲醇[赛默飞世尔科技(中国)有限公司],蒸馏水(北京屈臣氏蒸馏水有限公司),普通离心机(北京白洋离心机厂),高速离心机[艾本德(上海)国际贸易有限公司],7600-110全自动生化分析仪[日立(中国)有限公司]。

1.3方法

1.3.1标本采集 采集研究对象空腹静脉血后静置30 min，待血液凝固后以3 000 r/min离心，分离血清，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2胆汁酸亚组分检测 本研究检测的22种胆汁酸亚组分按结构主要分为游离型与结合型胆汁酸两大类，其中游离型胆汁酸包括胆酸(CA)、脱氧胆酸(DCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、γ-鼠胆酸(γ-MCA)、β-鼠胆酸(β-MCA)、α-鼠胆酸(α-MCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、12-酮基石胆酸(12-ketoLCA)、3-脱氢胆酸-1(3-DHCA-1)、石胆酸(LCA)、23-脱甲胆酸(23-Norcholic Acid)、异石胆酸(IsoLCA)；甘氨酸结合型胆汁酸包括甘氨鹅脱氧胆酸钠盐(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸钠盐(GDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)；牛磺酸结合型胆汁酸包括牛磺胆酸(TCA)、牛磺猪脱氧胆酸钠盐(THDCA)、牛磺脱氧胆酸钠盐(TDCA-1)、牛磺猪胆酸钠盐(THCA-1)、牛磺熊脱氧胆酸二水合物(TDAD-1)。经反复的条件优化，确定质谱仪测定参数设置如表1所示。具体操作如下：依次吸取50 μL血清、20 μL内标液、150 μL甲醇沉淀剂于刻度离心管中，振荡混匀10 min后，19 852×g 离心15 min，取上清液100 μL，加入150 μL超纯水稀释，混匀后上机检测。工作曲线的溶液配制：吸取10 μL标准品工作液(L1～L8)、40 μL空白基质加入离心管中涡旋混匀，后续操作同血清的处理过程。液相条件：色谱柱为Shim-pack Velox SP-C18，2.7 μm，2.1 mm×100 mm，流动相A相为0.01%甲酸水，B相为乙腈，柱温50 ℃，流速0.25 mL/min。质谱条件：电喷雾电离源，负离子电离模式；脱溶剂500 ℃,毛细管电压3 000 V，锥孔气150 L/H，脱溶剂气1 000 L/H，采用多重反应监测(MRM)进行扫描。根据CLSI C62-A和《液相色谱-质谱临床应用建议》，本实验批间精密度、批内精密度、准确度、线性、携带污染率等均已通过性能验证标准。

表1 质谱仪检测22种胆汁酸亚组分的参数设置

1.3.3总胆汁酸检测 使用7600-110全自动生化分析仪检测血清总胆汁酸，方法为循环酶法。

1.4统计学处理 采用SPSS26.0软件进行数据分析。计量资料进行正态性检验，非正态分布以M(P25，P75)表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验；以P2.5～P97.5作为参考区间；计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同性别健康成年人总胆汁酸及胆汁酸亚组分水平比较 不同性别健康成年人总胆汁酸及胆汁酸亚组分水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2中青年组与老年组胆汁酸亚组分构成比较 中青年组、老年组胆汁酸亚组分构成均以甘氨酸结合型胆汁酸为主，分别占49.47%和46.65%，其次为游离型胆汁酸，分别占43.32%和45.74%，以牛磺酸结合型胆汁酸占比最低，分别占7.21%和7.61%，两组间甘氨酸结合型胆汁酸、游离型胆汁酸、牛磺酸结合型胆汁酸占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 不同性别健康成年人总胆汁酸及胆汁酸亚组分水平比较[M(P25，P75),ng/mL]

性别nGUDCAGCDCAGLCAγ-MCAβ-MCAα-MCA男15534.00(14.01,98.35)295.25(154.92,655.52)2.94(1.44,7.37)3.97(1.41,8.53)0.24(0.16,0.46)0.86(0.16,3.52)女9545.72(13.47,103.93)279.86(120.91,540.14)2.59(1.68,7.28)3.07(1.38,8.15)0.21(0.15,0.53)1.08(0.16,3.27)P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

性别nCA3-DHCA-1CDCAHDCAUDCADCA男15532.80(15.12,91.76)0.76(0.34,1.97)134.16(46.01,271.82)2.96(1.13,11.25)23.44(5.16,69.01)45.93(4.75,109.42)女9538.45(16.29,85.05)0.94(0.43,2.99)115.46(38.96,317.20)2.21(0.81,10.50)21.93(5.37,83.93)34.99(0.51,122.42)P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

性别n12-ketoLCALCATHCA-123-NorcholicAcidIsoLCA男1552.16(0.47,5.03)2.08(0.48,5.79)0.25(0.02,0.62)2.51(1.26,5.62)3.21(1.14,6.84)女952.19(0.44,5.48)1.41(0.00,4.49)0.18(0.00,0.61)3.47(1.60,8.75)2.64(0.91,5.05)P>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

2.3中青年组与老年组胆汁酸亚组分参考区间的建立 中青年组血清THDCA、GDCA、GLCA、γ-MCA、β-MCA、CDCA、HDCA、UDCA、12-ketoLCA、LCA和THCA-1水平分别为0.00(0.00，0.51)、54.50(16.14，112.69)、2.57(1.16，7.21)、3.08(1.39，7.39)、0.21(0.07，0.35)、114.88(36.92，229.68)、2.56(1.25，6.65)、21.61(5.41，56.15)、2.35(0.47，5.55)、2.56(0.69，5.74)、0.32(0.15，0.70)ng/mL；老年组分别为0.02(0.00，1.18)、42.82(10.27，90.55)、2.99(2.05，7.38)、3.93(1.39，10.66)、0.27(0.11，0.74)、134.05(46.29，359.79)、2.48(0.81，18.83)、24.30(4.24，97.41)、1.81(0.45，4.63)、1.42(0.05，4.72)、0.42(0.15，0.89)ng/mL，两组上述各项比较，差异无统计学意义(P>0.05)。故两年龄组上述各项可使用统一的参考区间。中青年组与老年组血清TCA、TDCA-1、TDAD-1、GUDCA、GCDCA、α-MCA、CA、3-DHCA-1、DCA、23-Norcholic Acid和IsoLCA水平比较，差异有统计学意义[TCA(P=0.032)、TDCA-1(P=0.001)、TDAD-1(P=0.003)、GUDCA(P=0.008)、GCDCA(P=0.011)、α-MCA(P=0.034)、CA(P=0.041)、3-DHCA-1(P<0.001)、DCA(P=0.044)、23-Norcholic Acid(P<0.001)和IsoLCA(P=0.003)]，故两年龄组上述各项应建立各自的参考区间。胆汁酸亚组分数据均为非正态分布，参考区间见表3～5。

表3 部分胆汁酸亚组分参考区间(中青年组、老年组共用,ng/mL)

表4 中青年组部分胆汁酸亚组分参考区间(ng/mL)

表5 老年组部分胆汁酸亚组分参考区间(ng/mL)

2.4总胆汁酸与22种胆汁酸亚组分水平的相关性分析 总胆汁酸与22种胆汁酸亚组分水平均无相关性(P>0.05)；THDCA与TCA、TDCA-1、TDAD-1、THCA-1水平呈正相关(r=0.649、0.619、0.671、0.691，P<0.001)，UDCA与TDAD-1、GUDCA、CDCA、HDCA水平呈正相关(r=0.656、0.655、0.605、0.633，P<0.001)，CA与CDCA、HDCA水平呈正相关(r=0.603、0.628，P<0.001)，LCA与GLCA、12-ketoLCA水平呈正相关(r=0.678、0.636，P<0.001)，DCA与12-ketoLCA水平呈正相关(r=0.661，P<0.001)。

3 讨 论

总胆汁酸及胆汁酸亚组分水平的细微变化在调节脂质代谢、葡萄糖代谢以及能量平衡中所起的重要作用已成为近年来研究的热点[8]。此外，肝胆、胃肠、神经系统疾病等也与患者体内胆汁酸亚组分水平与比例的变化有关[9-10]。胆汁酸膜受体G蛋白偶联受体5(TGR5)与核受体法尼酯衍生物X受体(FXR)-α不仅是胆汁酸合成和运输的调节因子，也是胆汁酸调节的转录因子和保护传感器，故肝脏的代谢变化可以体现在胆汁酸亚组分的水平或比例变化中[11]。有研究分析了70例慢性浅表性胃炎、肠化生和胃癌患者的胃液标本，发现CA和DCA的代谢变化与胃癌的进展有关[12]；还有研究发现，胆固醇稳态的破坏与肝性脑病发生风险的增加有关，且脑积累的胆固醇通过胆汁酸介导的FXR作用促进肝性脑病的进展，故以肠道微生物-胆汁酸-脑轴为靶点可能是治疗肝性脑病的新策略[13]。

近年来，科研和临床工作者已陆续使用酶法、免疫层析法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法等开展了对胆汁酸亚组分的研究。液相色谱-串联质谱法逐渐成为主流方法，因为其对血清胆汁酸亚组分的区分和定量能力较强，可迅速、准确地获得胆汁酸亚组分的代谢信息[12-13]。目前，胆汁酸亚组分与疾病关系的研究仍未被广泛开展，对胆汁酸亚组分谱的广泛研究有望为相关疾病的诊断、发病机制、预后、疗效观察研究等提供参考。

本研究发现，中青年组与老年组表观健康成年人中，部分血清胆汁酸亚组分(TCA、TDCA-1、TDAD-1、GUDCA、GCDCA、α-MCA、CA、3-DHCA-1、DCA、23-Norcholic Acid和IsoLCA)水平差异有统计学意义(P<0.05)。现有胆汁酸亚组分的研究主要集中于孕妇与新生儿，对中青年与老年人群的研究很少[14-16]，本研究发现的部分胆汁酸亚组分水平在中青年与老年人群间存在差异的原因尚不明确，有待进一步深入探讨。相比其他研究所得的孕妇的参考区间而言[17-18]，本研究所得的中青年、老年人群胆汁酸亚组分参考区间上限值更高，可能与孕妇年龄分布窄(多为20～30岁)以及其特殊的生理状态有关。本研究发现，血清总胆汁酸与胆汁酸亚组分水平间无相关性，故对于总胆汁酸水平大致正常者，胆汁酸亚组分水平可能存在偏离正常的情况，检测胆汁酸亚组分可能对某些疾病具有一定的诊断价值。本研究中，老年人群血清胆汁酸亚组分水平整体偏高，可能与其膳食纤维摄入减少及胆汁酸的代谢稳态改变有关[19-20]，但具体原因尚待进一步研究。

本研究尚存在不足之处，表观健康人群未纳入未成年人，因此参考区间的年龄适用范围仍需进一步优化。在后续研究中除了将表观健康人群作为参考标准外，也会前瞻性收集胆汁酸及其他肝胆功能指标异常的标本进行联合检测，这将有助于探索胆汁酸代谢在多种疾病早期诊断中的作用及与疾病发生的相关机制，有较高的临床研究价值。