高效液相色谱法测定复方胰酶片中胆酸和牛磺猪去氧胆酸的含量

唐 娜,宋 莉,贾丽华,戴 涌,张 莉

(1.陕西省食品药品监督检验研究院,西安 710065; 2.陕西省中医医院,西安 710003)

复方胰酶片是胰酶和猪胆膏制成的肠溶衣片,可促进蛋白质、淀粉及脂肪的消化,增强食欲,用于治疗消化不良、食欲不振等[1-2]。现有标准方法中主要是对胰酶进行了有效控制,而缺少对另一主要成分猪胆膏的有效控制。猪胆膏是猪胆去皮取汁,过滤,滤液浓缩成干膏而制得,其具有清热润燥、止咳平喘、解毒等作用[3],猪胆膏的生产工艺简单,所含成分久放易发酵变质,进而导致有效成分降低。胆汁酸是胆汁的主要成分,约占胆汁总量的50%～70%,主要由胆酸、牛磺猪去氧胆酸等组成。文献报道多采用薄层色谱扫描法、紫外分光光度法和酸碱滴定法等测定胆酸等的含量[4-10],但目前尚无文献报道复方胰酶片中胆酸和牛磺猪去氧胆酸的测定方法。现行标准对猪胆膏中的胆酸采用了反复回流等提取方法,操作复杂,容易造成样品损失,不能有效测定胆酸的含量。为了更好地控制药品质量,保证临床用药安全有效,本工作以猪胆膏所含有效成分胆酸和牛磺猪去氧胆酸为指标,建立了高效液相色谱法测定复方胰酶片中由原料猪胆膏引入的胆酸和牛磺猪去氧胆酸含量的方法,以期提高对猪胆膏所含有效成分的质量控制。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配G7115A型二极管阵列检测器、EMPOWRE色谱工作站;AE-240型电子分析天平;Millipore型超纯水机。

胆酸对照品储备溶液:2.50 g·L－1,称取胆酸对照品适量,加甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为2.50 g·L－1(即每1 mL中约含胆酸2.50 mg)的对照品储备溶液。

牛磺猪去氧胆酸对照品储备溶液:0.50 g·L－1,称取牛磺猪去氧胆酸对照品适量,加甲醇溶解并定容,配制成质量浓度为0.50 g·L－1(即每1 mL中约含牛磺猪去氧胆酸0.50 mg)的对照品储备溶液。

胆酸对照品溶液系列:移取胆酸对照品储备溶液适量,加甲醇溶解并稀释制成质量浓度分别为0.25,0.50,1.00,1.50,2.50 g·L－1(即 每1 mL各 含胆酸0.25,0.50,1.00,1.50,2.50 mg)的对照品溶液系列。

牛磺猪去氧胆酸对照品溶液系列:移取牛磺猪去氧胆酸对照品储备溶液适量,加甲醇溶解并稀释制成 质 量 浓 度 分 别 为 0.05,0.10,0.15,0.20,0.50 g·L－1(即每1 mL各含牛磺猪去氧胆酸0.05,0.10,0.15,0.20,0.50 mg)的对照品溶液系列。

胆酸对照品(批号100078-201415,纯度98.9%);牛磺猪去氧胆酸对照品(批号111943-201802,纯度96.8%);复方胰酶片3批均由某厂家提供。

甲醇和乙腈均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

十八烷基硅烷键合硅胶SunShell HFC18-30色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)测定胆酸,十八烷基硅烷键合硅胶Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)测定牛磺猪去氧胆酸;流动相为体积比35∶65的乙腈-0.1%(体积分数,下同)磷酸溶液的混合液;流量为1 mL·min－1;检测波长为192 nm;柱温为40℃;进样量为10μL。

1.3 试验方法

取本品10片,研细,分别称取样品0.3,0.5 g,加甲醇适量溶解,超声提取30 min,冷却,用甲醇分别定容至50,25 mL,摇匀,过滤,取续滤液分别作为测定胆酸和牛磺猪去氧胆酸的供试品溶液,按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按色谱条件测定胆酸对照品溶液、牛磺猪去氧胆酸对照品溶液,色谱图见图1。

图1 对照品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of the reference substance solutions

2.2 检测波长的选择

胆酸和牛磺猪去氧胆酸的吸收均为紫外末端吸收,试验采用二极管阵列检测器在190～400 nm内进行波长扫描,又分别选定192,200,205,210 nm的波长进行测定。结果显示:在波长200,205,210 nm处,目标峰响应低;在波长192 nm处,胆酸和牛磺猪去氧胆酸的响应较高。因此,试验选择192 nm作为胆酸和牛磺猪去氧胆酸的检测波长。

2.3 流动相的选择

试验比较了甲醇和磷酸二氢钠溶液、乙腈和磷酸溶液2种流动相体系对目标物分离效果的影响。结果显示:以甲醇和磷酸二氢钠溶液为流动相进行洗脱时,胆酸和牛磺猪去氧胆酸色谱峰的峰形差;而以乙腈和磷酸溶液为流动相进行洗脱时,胆酸和牛磺猪去氧胆酸色谱峰的峰形较好,灵敏度高。试验最终选择体积比35∶65的乙腈-0.1%磷酸溶液的混合液为流动相。

2.4 色谱柱的选择

试验考察了Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、SunShell HFC18-30 色 谱 柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)的分离效果。结果显示,Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)在测定胆酸时,存在保留时间过长、色谱峰前沿等问题,而对牛磺猪去氧胆酸的分离效果比较好。因此,试验选择SunShell HFC18-30色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)测定胆酸,而Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)测定牛磺猪去氧胆酸。

2.5 标准曲线和检出限

按照试验方法测定对照品溶液系列,记录色谱图。以目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标进行线性回归。胆酸和牛磺猪去氧胆酸的线性范围、线性回归方程及相关系数见表1。

以仪器的3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.6 精密度试验

按照试验方法测定对照品溶液,重复进样6次,记录色谱图,并计算所得峰面积的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度试验结果(n＝6)Tab.2 Results of test for precision(n＝6)

2.7 稳定性试验

按照试验方法测定对照品溶液,胆酸在放置0,2,4,6,8,21,29 h时进样分析,记录色谱图,计算胆酸峰面积的RSD,结果为0.41%;牛磺猪去氧胆酸在放置0,2,4,5,26 h时进样分析,记录色谱图,计算牛磺猪去氧胆酸峰面积的RSD,结果为3.4%。

2.8 回收试验

称取复方胰酶片样品适量,分别加入胆酸和牛磺猪去氧胆酸对照品溶液,按照试验方法平行测定6份,计算其回收率,结果见表3。

表3 回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

由表3可知:胆酸和牛磺猪去氧胆酸的回收率分别为91.9%和102%,RSD 分别为2.2%和1.5%。

2.9 样品分析

取3批供试品,分别按照试验方法测定其中胆酸和牛磺猪去氧胆酸的含量,结果见表4。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of samples

本工作建立了高效液相色谱法测定复方胰酶片中胆酸和牛磺猪去氧胆酸的方法。该方法能有效测定复方胰酶片中胆酸和牛磺猪去氧胆酸的含量,操作简便、快速,灵敏度高、重现性好,能够有效控制复方胰酶片的质量。