细胞焦亡对骨稳态的影响及展望

马子健 马明领 董辉 杨斌 王永祥

1.扬州大学临床医学院(苏北人民医院)骨科，江苏 扬州 225001

2.扬州大学医学院，江苏 扬州 225009

3.大连医科大学研究生院，辽宁 大连 116044

骨质疏松症是常见的骨代谢性疾病，依赖于成骨细胞和破骨细胞作用的平衡，一旦失衡就会导致骨量流失、骨密度下降、骨脆性增加等问题，其后果便是骨折及其并发症。常见的原发性骨质疏松见于老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松，继发性骨质疏松常见于糖皮质激素诱导的骨质疏松。骨质疏松是多因素造成的结果，结合早期对雌激素方面的研究，逐渐意识到炎症与骨质疏松密切相关，雌激素与人体的免疫系统有多种联系，并且雌激素可以减轻人体炎症反应导致的骨流失[1-2]，氧化应激也可以从炎症途径影响骨代谢平衡[3]。细胞焦亡是一种炎症相关的程序性细胞坏死，是人体的天然免疫屏障，当感染或者异常损伤时被激活，但目前还没有研究报道细胞焦亡在骨代谢中的作用机制。本综述主要结合最新研究进展，总结细胞焦亡的调控机制及其在骨质疏松方面的未来展望。

1 细胞焦亡

细胞焦亡是一种不同于凋亡和自噬的程序性死亡。早在2001年Boise等[4]总结前人经验将这种炎性细胞死亡称为“pyroptosis”—焦亡。其形态学特征是细胞发生肿胀，形成焦亡小体，细胞膜破裂，释放炎症因子。焦亡有经典途径和非经典途径。在经典途径中，细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)可以识别病原体相关分子模式(pattern recognition receptors，PAMPs)或损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，常见的PAMPs有细菌脂多糖、病毒RNA[5]等，而DAMPs包括受损的蛋白质、植入物碎片[6]等。Nod样受体(nod-like receptors，NLRs)作为焦亡途径中的经典受体，含有NLRP家族蛋白，并参加炎症小体的组装，当其受到响应时，又将信号传递给下游的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD，ASC)，并且通过募集pro-caspase-1从而组装成炎症小体。最常研究的有NLRP3、AIM2等炎症小体。募集的pro-caspase-1被剪切成有活性的caspase-1蛋白酶，也被称为含有半胱氨酸的天冬氨酸水解酶，caspase家族蛋白在细胞凋亡途径中尤为重要[7]，而在焦亡的经典途径中最为重要的是caspase-1。激活的caspase-1不仅可以切割炎症因子IL-1b和IL-18的前体促进其成熟，而且可以剪切效应蛋白gasdermin D(GSDMD)以暴露N-末端效应结构域。后者与细胞膜结合形成孔道，使细胞内的IL-1b和IL-18释放，并募集周围的炎症因子，同时水及钠离子进入细胞破坏正常的内外渗透压平衡，导致细胞肿胀破裂，内容物释放[8]。非经典途径主要是细菌脂多糖(LPS)直接与caspase-4/11/15结合并激活炎症小体及GSDMD诱导焦亡，与感染性疾病发生发展密切相关[9]。在经典途径中最为主要的调控因子是NLRP炎症小体及下游的炎症因子，但有研究证明焦亡在骨关节炎起到重要作用，而且NLRP3也与骨代谢的通路密切相关[10]。

2 细胞焦亡在骨稳态中的探索

2.1 焦亡与破骨细胞

炎症小体是是由受体蛋白NLR或ALR、接头蛋白ACS及效应蛋白caspase组成的复合体。NLRP3炎症小体的上调需要NF-kB通路来实现[11]，而NF-kB通路在破骨细胞活化中是最为经典的通路之一[12]。研究发现[13]，在破骨细胞中特异性表达Nlrp3D301 N的中，Nlrp3D301 N的高表达会导致骨量丢失，主要是由于NLRP3促成的IL-1b等炎症因子发挥作用，进一步活化破骨细胞引起骨吸收作用。

引起骨质疏松的外界因素有空气中的镉等重金属[14]，但Chen等[15]发现铝诱导的骨丢失可以引起人体氧化应激和炎症因子增加，并导致NLRP3的上调，但经烟酰胺单核苷酸处理后的小鼠血清中IL-1b、IL-18等炎症因子显著下降，ASC、caspase-1炎症蛋白表达下降，从而减缓铝诱导的骨损伤。在牙周炎这种感染性炎症性疾病引起的骨吸收中，NLRP3能够促进破骨细胞分化，并且通过敲除NLRP3基因，发现NLRP3缺失可使IL-1β释放受阻并抑制破骨细胞分化[16]。但有研究发现[17]，通过细菌诱导炎症的中，敲除NLRP3基因骨吸收程度并没有降低，反而在caspase-1 KO的小鼠中骨吸收减弱，但是破骨细胞数量反而增加，提示caspase-1可能参与炎症性骨吸收作用。

2.2 焦亡与成骨细胞

细胞焦亡与代谢性疾病如糖尿病密切相关[18]，而糖尿病引起的骨质疏松也被广泛研究，胰岛素缺乏及高血糖引起氧化应激可导致成骨细胞功能障碍[19]。Yang等[20]通过建立体内和体外糖尿病模型，通过检测高糖环境中焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD的表达水平上升，证明了高糖可以激活牙槽骨成骨细胞的焦亡；并且使用capsase-1抑制剂可以使高糖对成骨细胞的增殖分化的抑制作用下降，从而证明了高糖可以通过焦亡途径抑制牙槽骨成骨细胞的增值和分化。另外，研究发现[21]，通过粪肠杆菌感染成骨细胞MG63细胞，上调了caspase-1和NLRP3炎症小体的表达，并使用caspase-1抑制剂处理和siRNA沉默NLRP3后，通过检测细胞LDH释放减少以此来说明以上处理导致焦亡减弱，说明NLRP3参与了粪肠杆菌诱导成骨细胞的焦亡途径。而且Liu等[22]从LPS诱导成骨细胞氧化应激的角度证明了焦亡的存在，抑制焦亡可以增强成骨细胞的分化和活性。

3 NLRP3在骨稳态中的研究

作为经典的炎症小体，NLRP3在炎症性骨病中已被广泛研究，如类风湿关节炎[23]、强直性脊柱炎[24]、骨髓炎[25]等。但是炎症小体在焦亡通路中的作用机制尚未完善。炎症小体的激活需要NF-kB通路以及有效激动剂如离子转移、ROS等[18]。研究发现[26]，鸢尾素作为一种与运动相关的骨骼肌分泌物，与绝经后骨质疏松密切相关。经鸢尾素治疗的OVX大鼠，通过检测出抗氧化因子Nrf2蛋白高于骨质疏松组，而NLRP3表达相反；并且治疗组中与凋亡相关的caspase-3和NLRP3表达下降及Runx2 成骨基因的mRNA水平显著上调，成骨细胞凋亡减少，说明了鸢尾素能够诱导Nrf2的上调，减少了成骨细胞的凋亡并且抑制NLRP3的表达。可见炎症小体并不是细胞焦亡的专属，其实细胞凋亡和焦亡之间存在交互关系。与凋亡相关的caspase-8能够激活caspase-3切割Pannexin-1通道蛋白[27]，Pannexin-1促进钾离子外排并开启NLRP3的组装[28]，caspase-8是调控细胞死亡方式的中间点，NLRP3·ASC炎症小体可以募集caspase-8，若caspase-8有活性则激活下游的caspase-3引发凋亡，否则激活caspase-1引发焦亡[29-30]。与凋亡相关的caspase-3/8甚至可以直接作用于GSDMD家族蛋白引发焦亡，而GSDMD成孔效应的延迟则可能使焦亡转化为凋亡。有研究表明[31]，通过脂多糖或软脂酸激活间充质干细胞中的NLRP3炎性小体发现成骨分化减弱，脂肪分化加强，并且通过抑制下游效应蛋白caspase-1，可以抑制这种成脂分化和轻度改善成骨效应。Xu等[32]通过建立OVX，发现褪黑素能够抑制NLRP3在成骨细胞中的表达，并且改善了NLRP3对骨髓间充质干细胞胞向成骨分化的抑制作用。还有研究表明骨基质成分可以作为DAMPS激活NLRP3的表达来刺激破骨细胞的分化，从而维持骨吸收过程[33]。总结多项研究可以看出炎症小体在骨稳态中的作用正在不断被挖掘，但是很多研究未能真正将细胞焦亡与骨稳态和骨质疏松疾病联系起来，而只是停留在炎症小体的研究上，很大程度上是细胞焦亡的机制还没有被完全解释清楚，以及细胞焦亡与凋亡等其他细胞死亡方式是否存在密切关系，这些都有待进一步研究。

4 IL-1b、IL-18相关作用

作为焦亡途径的下游信号，IL-1b和IL-18是关键的炎症因子，也是焦亡发生的效应物质。IL-1b和IL-18同属于IL-1家族成员，具有相似的信号传导通路[34]，两者经caspase-1切割后暴露活性，引起级联炎症反应。早已被证明骨关节炎、类风湿关节炎等炎症性骨病与IL-1b、IL-18等炎症因子密切相关，如IL-1b、IL-18骨关节炎患者的关节液中表达过高[35-36]，而这些炎症性骨病甚至会导致骨密度降低、骨稳态紊乱，继而引发骨质疏松[37]。IL-1b和IL18也有相互促进分泌的作用[38]。

IL-1b骨折愈合的重要因素之一[39]。总体来说IL-1b在骨稳态的作用是促进骨吸收，IL-1b通过上调RANKL及招募巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)来促进破骨细胞前体的分化和成熟[40-41]，并且增强破骨细胞的活性。Zhuang等[42]在构建小鼠牙周炎模型中通过诱导M2型抗炎巨噬细胞，发现IL-1RA(白细胞介素1受体拮抗剂)mRNA表达升高，RANKL表达下降，并降低了破骨细胞的活性。并且另一研究证明IL-1RA缺陷会增加破骨细胞的形成[43]。当IL-1b与相应受体结合后，引起下游NF-kB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、活化蛋白-1(AP-1)等多种因子上调，启动c-Fos信号，从而导致破骨细胞相关基因转录[44-45]，阿托伐他汀则可以抑制IL-1b引起的NF-kB和MAPK信号，从而抑制破骨细胞分化[46]。另外，IL-1b似乎与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)密切相关，早在许多年前就有这方面的研究，极低浓度的IL-1b和TNF-α可以协同刺激破骨细胞生成[47]，TNF-α是公认的破骨细胞相关因子，降钙素基因相关肽可以抑制IL-1b和脂多糖刺激成骨细胞产生TNF-α，并间接降低破骨活性[48]。而且IL-1可以抑制成骨细胞产生的骨保护素(OPG)，间接增强了破骨活性[49]，但García-Lpez等[50]从机械应力的角度发现在体外培养的成骨细胞上清液中IL-1b、TNF-α等破骨相关因子上调的同时，OPG也随之上调，说明细胞因子对成骨细胞具有多通路影响。

而IL-18对骨稳态的作用相对复杂。早期研究证明，IL-12和IL-18可以协同抑制破骨细胞活性，但二者均不能直接作用于破骨前体细胞[51]。而IL-18可以促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[52]。IL-18可由T淋巴细胞、自然杀伤细胞等分泌，也有研究证明成骨细胞也具备分泌IL-18的能力[53]。有研究表明[54]，IL-18 可以调节体内成骨细胞的骨合成代谢，并且受甲状旁腺素的调控。IL-18可以从以下几个方面来影响人体的骨代谢平衡：(1)IL-18通过作用于T细胞释放粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，从而抑制破骨细胞活性[55]；(2)IL-18通过作用于T细胞和单核巨噬细胞产生TNF-α，从而间接刺激破骨细胞活性[56]；(3)IL-18和IL-12协同通过作用于辅助性T细胞产生IFN-γ(interferon-γ)，一方面可以下调RANKL，抑制RANK信号传导，并且抑制TNF-α诱导的破骨细胞分化；但另一方面，IFN-γ通过作用于T细胞分泌破骨因子RANKL和TNF-α，并且在病理条件下又可以激活破骨细胞[57-59]。

5 总结与展望

细胞焦亡作为一种新型的炎症性程序性死亡，与传统的凋亡和坏死既有区别又有共性，焦亡相关蛋白的研究正在广泛地进行，关于焦亡还有很多需要探索，比如细胞焦亡是否具有自我调节机制，从而避免焦亡过度激活造成组织损伤，以及GSDMD成孔效应是否受到细胞内外环境的调控。而目前研究细胞焦亡在骨稳态中的影响，无论是对成骨细胞还是破骨细胞，往往研究的是焦亡引起的炎症因子IL-1b和IL-18对二者的影响，NLRP3炎症小体、caspase蛋白家族以及IL-1b和IL-18可以作为治疗骨质疏松的靶点，但仍要思考的是一方面能否给出成骨细胞和破骨细胞焦亡的形态学证据，以及要证明在发生骨质疏松常见的部位如股骨、腰椎等是否有焦亡的存在；另一方面，焦亡相关蛋白是否可以参与已研究的成骨细胞和破骨细胞通路，如OPG/RANKL/RANK、Wnt/β-catenin等，这些都有待进一步研究。