外泌体与骨质疏松相关研究进展

朱世壮 杨大志

1. 广东医科大学，广东 湛江 524000

2. 广东医科大学，深圳市第六人民医院脊柱外科，广东 深圳 518000

骨质疏松症是一种由多种原因导致的骨密度减低及骨量减少，骨微结构退化致使骨脆性增加的全身性代谢性疾病[1-2]。随着年龄的不断增长，骨质疏松性骨折的发病率亦日渐增加。因此诊断和预防骨质疏松症及减少其并发症成为重要的公共卫生问题。针对骨质疏松症，其药物治疗是目前研究的热点。但任何疾病，治疗固然重要，而预防都应放在第一位。除了指导有高危因素的人群采取合理的预防措施，如进行适当的锻炼及坚持服用钙片等药物外，还应从科研医务工作者出发努力研发能够预测骨质疏松症的生物标志物，从而有效达到一级预防的目标。目前，外泌体已被证实在骨代谢中发挥着极其重要的作用。最近的研究也表明外泌体在维持细胞内稳态及调节细胞间通信中发挥重要作用。本文通过综述近年来骨来源外泌体的研究进展，期待为骨质疏松症的诊断及治疗提供新的思路。

1 外泌体的结构及功能

1.1 外泌体的来源及成分

外泌体是由间充质干细胞、内皮细胞、成纤维细胞等体内多种细胞产生并分泌且具备脂质双分子层结构的直径在30～200 nm之间的囊泡。其内包含多种生物活性物质，如脂质、蛋白质、DNA及microRNA等，且通过主动分泌的方式分泌到机体的组织液中[3-4]。

1.2 外泌体的获取及转运检测方式

可以通过检测相应的组织液如血液、唾液、精液等，达到监测、获取以及分析外泌体的目的。因此可以从骨髓中提取得到骨髓间充质造血干细胞来源的外泌体。相关研究表明，在-20 ℃条件下储存5年几乎不影响血microRNA的总体数量，即在不同温度和不同储存时间下血浆外泌体中循环microRNA具备较强的稳定性[5-6]。目前，通过超速离心和蔗糖梯度离心法，即可以得到相对质量较高的外泌体。在这方面，超滤法、亲和层析法及沉淀法亦各有优缺点，可根据自我实验的要求及目的，选择适当的方法[7]。

随着研究的进一步深入，从体液、细胞甚至组织等材料中分离外泌体的方法也日益成熟。以上这些特性，使得外泌体microRNA在生物标志物方面具备极高的应用前景。

1.3 外泌体的生物学功能

外泌体通过与靶细胞结合，发挥生物学作用。而大量研究表明，不同细胞来源的外泌体，其生物学功能亦不尽相同。而骨细胞来源的外泌体具有调节骨代谢的作用，其中，Qin等[8]指出，外泌体可以通过调节骨生成和血管生成发挥刺激骨再生的作用。一方面外泌体具备参与除细胞外介质的信息传递和交流的作用；另一方面，对不同骨细胞，外泌体具有一定的修复及促进再生的作用，并以此来调控骨组织的正常及病理状态[9-10]。

2 骨来源外泌体与骨质疏松症

2.1 外泌体microRNAs

近年来，关于外泌体内microRNA如何调节受体细胞功能及活性已成为相关领域研究热点。外泌体中富含多种microRNAs，且骨来源的外泌体中microRNA在骨平衡中具备重要的作用。已知，microRNA通过调控成骨细胞及破骨细胞的分化及活性，介导骨质疏松的发生及发展。microRNAs转录后通过调控调转录产物从而控制成骨细胞及破骨细胞的生物活性[11]。骨质疏松症的发生和发展亦伴随着多种microRNA表达的异常[12]。而通过检测骨组织来源的外泌体中所含microRNA种类、含量及活性改变的情况，便可以为骨质疏松症的预防、诊断乃至治疗及预后提供新的思路。未来，亦有可能将骨起源的外泌体作为骨疾病尤其是骨质疏松症的生物标志物。

徐月新[13]指出，microRNA转录水平或microRNA 分泌水平的特异改变都和骨骼疾病的发生及发展密切相关，microRNA 在调控骨重构的成骨细胞及破骨细胞的分化和活性方面具备极其重要的作用。Ell等[14]研究发现，血清中sICAM1和两种破骨细胞microRNA(miR-16和miR-378)的水平在破骨细胞分化中升高，表明其与骨转移密切相关；而功能研究表明，异位表达下调miR-141和miR-219后，破骨细胞发育受损和骨转移风险降低。这些发现证明miRNAs在骨转移过程中破骨细胞发生的重要调控因子和潜在的治疗靶点和生物标志物，即miRNAs有成为骨转移的潜在治疗靶点和临床生物标志物的可能[14]。

目前已明确报道，骨起源的外泌体中，与骨重建相关的microRNA有let-7、miR-10b-5p、miR-24、miR-199b、miR-143-3p、miR-214-3p 、miR-218。有研究通过分析骨质疏松症组与骨量减少组共372个共同表达的miRNA，得出均与正常对照组有差异的microRNA，共39个，其中5个miRNA表达量较高且具有较为显著的差异，分别为miR-584-5p、miR-92a-3p、miR-484、m222-3p、miR-155-5pP。这些筛选出来的microRNA，极可能成为骨量减少乃至骨疾病如骨质疏松症的潜在分子标志物，具有极强的应用前景[15]。进一步研究[16]发现，miR-506-3p可以选择性抑制RANKL诱导激活的大鼠BMMs中的NFATc1，进一步减少了骨吸收必需的骨吸收酶的释放，从而达到缓解骨溶解的作用。以上这些miRNA将成为未来骨质疏松症分子生物学的重点研究对象，为骨质疏松症的早期预防、诊断及治疗提供重要的分子生物学参考。然而，骨组织来源的microRNA在骨细胞间信息交流的具体机制及其作用靶点还需要进一步研究[17]，为后续其在骨组织生物学方面的应用提供更多的实验依据。

2.2 外泌体与破骨细胞

有研究[18]显示，miR-21的表达受破骨细胞形成的转录因子特别是c-Fos的控制，RANKL刺激的miR-21表达可能是破骨细胞形成的必要条件。miR-21可能是治疗具有过度破骨细胞发育和活性的骨代谢疾病(如骨质疏松症)的新靶点。未来，破骨细胞microRNA中有可能成为破骨细胞异常活性疾病如骨质疏松症的潜在治疗靶点。当然，目前尚缺少下一步的体内研究，但可以肯定的是，miR-21在治疗骨质疏松等破骨细胞的过度发育及其活性功能紊乱性疾病中成为治疗的靶点。

在Deng等[19]的研究中，PTH处理UAMS-32P细胞制备的外泌体可显著促进破骨细胞前体分化的功能可以通过添加RANKL抗体或骨保护素来阻止。而通过活化T细胞核因子的易位(这是对RANKL反应的破骨形成的主要调节因子)，表明了PTH处理的UAMS-32P细胞释放的外泌体激活了NFATc1核易位，证实了由外泌体介导的RANKL蛋白从成骨细胞转移到破骨细胞前体后具备诱导破骨细胞形成的功能。体外实验[20]表明，miR-128通过miR-128/SIRT1/NF-kB信号轴调控破骨细胞形成，过表达或抑制miR-128可分别显著增加或减少破骨细胞的生成。不难发现，外泌体对破骨细胞的作用可能具有双向性，其影响骨重建的分子机制尚未明确，这也是接下来我们进行体外及体内实验所研究的重点方向。

2.3 外泌体与成骨细胞

成骨细胞来源于间充质干细胞，具备进一步发育成为骨细胞的潜能。在适宜的刺激下，成骨细胞经历增殖与成熟，通过合成分泌骨基质及相关蛋白调控骨形成过程[21]。破骨细胞主要通过外泌体分泌miR214-3p。Li等[22]检测到，破骨特异性miR-214-3p敲入小鼠的血清外泌体中miR-214-3p显著升高，进一步分析目标小鼠的骨表型，发现其骨形成减少，证明外泌体miR214-3p在体外靶向成骨细胞抑制骨形成；而通过每周脉冲注射antagomiR214-3p，通过骨组织形态学分析显示骨形成和骨吸收相关参数几乎恢复至野生型小鼠的水平，进一步证明了破骨靶向的antagomir-214-3p治疗可恢复骨生成。因此，miR-214-3p可能用于骨代谢疾病如骨质疏松的诊疗。徐轶尔等[23]通过生物信息学分析，表明与成骨分化相关的不同外泌体miRNA模式的量化表达丰富，其中RNA降解、mRNA监测通路、Wnt信号通路、RNA转运通路最为显著。这些数据表明了外泌体microRNA是成骨细胞分化的调节因子。在RANKL 再生及骨重建等方面，Wnt 信号通路均起到极其重要的调节作用，其已被视为骨质疏松症发生发展的重要病理生理学基础。通过进一步分析成骨细胞起源的外泌体中的microRNAs，得知表达明显升高的microRNA包含：miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p、miR-335-3p、miR-378 和miR-378b以及miR-677-3p等，它们共同作用于Wnt 信号通路，从而促进成骨细胞分化。

一方面，目前大多数研究尚局限于检测出同骨质疏松症相关的microRNA，而对于其影响骨质疏松进展的具体机制尚需进一步深入研究；另一方面，尚缺少大量的临床实验来进一步验证以上通路中microRNA所起的具体作用，尤其是其在具体疾病的治疗方面仍存在极大的研究空间。由于microRNA通过调控成骨细胞及破骨细胞进一步介导骨质疏松症的发生及进展，因此，对于外泌体同成骨细胞亦或破骨细胞之间的关系，大多都可以联系到外泌体中microRNA的变化。或者，可以将microRNA视为外泌体介导甚至治疗骨质疏松症的重点研究对象。

2.4 外泌体与骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞作为成骨细胞前体，越来越多的骨髓间充质干细胞来源的外泌体被报道应用于各种动物实验。其中，Furuta等[24]认为外泌体是间充质干细胞旁分泌信号通路的一种新因子，且其在组织修复过程中具备重要的作用。Zhang等[25]初次证明了人类胚胎间充质干细胞外泌体具有软骨修复的生物学效应，并指出间充质干细胞外泌体可以用于间充质干细胞治疗替代疗法。徐轶尔等[23]报道了在骨髓间充质细胞成骨分化过程中，外泌体来源的miRNA的表达程度不尽相同。其中参与介导mRNA监测及Wnt通路等信号通路的miRNA共有79种。Phinney等[26]指出，在骨髓间充质干细胞生物学中的作用方面，尽管外泌体还存在许多疑惑，但其指出了应用骨髓间充质干细胞来源的外泌体具有以下几个优势：首先，它们的使用避免了可能发生突变或损坏DNA的细胞的转移。第二，相较于骨髓间充质干细胞太大且不易通过毛细血管循环而言，外泌体囊泡小且容易循环，许多骨髓间充质干细胞不能通过第一通道毛细血管床，通常是肺(尽管有些能明显通过)。第三，移植后注入的骨髓间充质干细胞的剂量会迅速减少，而且骨髓间充质干细胞来源的囊泡的输送可能会达到比大细胞更大程度循环的更高 “剂量”。Zuo等[27]通过将骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉注射至因辐射导致骨质疏松的小鼠体内，通过显微CT观察小鼠胫骨并进行组织形态学分析，得出骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过恢复受体骨髓间充质干细胞的功能发挥抗骨量丢失的作用，并以此提出外泌体在无细胞治疗方面具备极高的应用前景。

以上相关研究表明骨质疏松症的治疗，不仅仅局限于成骨细胞及破骨细胞的层面，相较于单纯的成骨细胞而言，成骨细胞前体即骨髓间充质干细胞来源的外泌体具有更大的优势。因此，其在抗骨质疏松疾病中的骨量丢失方面亦具有极高的应用前景。

3 外泌体治疗骨质疏松相关研究

Youssef等[28]强调了合成外泌体在治疗骨损伤及相关骨疾病方面的优越性。一方面，外泌体通过内吞、融合等多种不同方式介导其内部的生物活性物质进入靶细胞，从而发挥相应的生物学功能；另一方面，外泌体与靶细胞结合方式的多样性，使得其在治疗骨损伤与骨疾病方面具有多种不同的使用方式，如药物递送剂、生物制剂等，从而在疾病的早期诊断及治疗中发挥极大的优势。

Snx10作为调节细胞膜运输的分选连接蛋白，定位于破骨细胞早期核内体，具有调节细胞膜运输的功能。Zhu等[29]发现沉默Snx10抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和破骨细胞在羟基磷灰石上的吸收，也抑制TRAP的分泌，从而证实Snx10在破骨细胞中表达，且是体外破骨细胞分化及发挥活性所必需的。Battaglino等[30]通过酵母双杂交筛选并鉴定了FKBP12，观察到Snx10和FKBP12同早期核内体抗原1 (EEA1)存在于蔗糖梯度离心得到的同一亚细胞组分中，表明FKBP12亦定位于早期核内体，即Snx10和FKBP12作为合作伙伴，共同参与内吞体/溶酶体稳态的调控。这些发现可能为通过靶向破骨细胞膜转运的关键步骤来控制骨量丢失提供了新的治疗方法。

Hu等[31]将CXCR4+外泌体与携带antagomiR-188的脂质体融合，产生混合纳米颗粒。检测发现，杂交混合纳米颗粒特异性聚集于骨髓，并通过释放antagomiR-188从而促进骨髓间充质干细胞成骨，抑制脂肪的生成，从而逆转小鼠年龄相关性骨小梁丢失，发挥降低皮质骨孔隙率的作用。miR-188随年龄增长显著升高，显著促进骨髓间充质干细胞成脂，抑制成骨。在老龄小鼠中，miR-188的下调逆转了与年龄相关的骨髓间充质干细胞成脂分化的转移，并改善了骨量丢失。本研究为构建用于RNAi传递的骨靶向NPs作为老年骨量丢失的合成代谢治疗提供了一种新策略。

陈逸青等[32]也进一步论述了外泌体在骨吸收及骨形成中的作用，并进一步提出外泌体在骨质疏松症的诊断、治疗及预后方面的预测具有极高的应用前景。但是，目前外泌体治疗骨质疏松症的相关研究主要还集中在动物实验，鲜有实验涉及到机体的干预及治疗。未来，需要在进一步明确外泌体介导骨质疏松症具体机制的前提下，进一步开展临床试验，从而真正达到外泌体治疗骨疾病(骨质疏松症)的目标。

4 展望

目前对于外泌体，已经有了成熟可靠的检测技术，外泌体中与疾病相关联的microRNA的种类及其生物学功能检测亦取得了极大地进展。然而，骨组织来源的microRNA在骨细胞间信息交流的具体机制还需要进一步研究。未来，将进一步明确外泌体中与骨质疏松症相关联的特异性microRNA在骨细胞间信息交流的具体机制及其作用于骨质疏松症的分子生物学机制，并以此为突破点，致力于骨质疏松症早期预防、早期诊断及抗骨质疏松生物靶向药物的研发。而某些特殊的血清外泌体蛋白质组能否作为有效的骨质疏松分子标志物还需要进一步研究。

综上所述，本文主要就外泌体在骨质疏松症方面的研究现状进行了综述。随着研究方法的进步，也会有更多的外泌体被发现，其作用于骨质疏松的具体机制也会更加深入，相信未来外泌体在骨质疏松症早期预防、早期诊断及抗骨质疏松生物靶向药物的研发方面会有极高的应用价值，而这也正是未来研究的重点。