自噬在糖皮质激素性骨质疏松症中的作用机制

张惜燕 胡勇 邢玉瑞

陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

糖皮质激素(glucocorticoid，GC)作为抗炎和免疫抑制剂，在临床上使用最为广泛且有效。长期应用GC对骨组织及肌肉组织产生不可逆转的损伤，从而导致糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)。GIOP是临床最常见的继发性骨质疏松症[1]，其特征是骨重塑的持续变化，骨形成减少，骨吸收增加，同时骨质量下降，导致骨折的发生率增加。研究证实，自噬作为维持恶劣微环境下细胞内稳态的重要机制，在调控骨骼的动态平衡中发挥关键作用[2]。然而，针对由GC长期应用所形成的GIOP，自噬在其中的作用机制值得进一步深入研究。

1 GIOP发病机制

骨稳态失衡，即破骨-成骨的动态平衡被打破，是OP发生的核心机制。然而在GIOP的发生发展过程中，GC通过直接或间接作用影响骨组织微环境中多种参与骨形成相关细胞，同样抑制了骨活动和骨形成，但其机制主要表现在：①骨丢失增加。GC抑制小肠的钙、磷吸收，一方面肾脏尿钙排泄增加，引起继发性甲状旁腺功能亢进；同时，减少雌激素及睾酮的合成，干扰细胞骨架，最终促使破骨细胞活化，骨丢失增加。②骨形成抑制。GC抑制Ⅰ型胶原和非胶原蛋白质合成，成骨细胞增殖变弱，骨细胞凋亡[3]。③骨质量、骨强度降低。GIOP导致椎体骨折风险明显增高，GIOP患者发生骨折的骨密度阈值相较于绝经后OP患者明显增高，说明GC对骨小梁影响更大，对松质骨的影响大于皮质骨[4]。同时，老年性和绝经后骨质疏松症，其骨质溶解主要是通过增加破骨细胞的数量和功能，而GIOP主要是由成骨功能受损引起的。另外，GIOP骨代谢与GC用药时间具有相关性。研究表明，应用GC 18个月以内，患者骨代谢状态处于高分解、低成骨状态，超过 30个月以上，患者骨代谢状态则处于低分解、低成骨、低转换状态[5]。可见，GIOP的发病机制在OP基础上有其自身特点。

2 自噬与GIOP的相关性

自噬通过溶酶体降解、清除途径来维持细胞内稳态。近年来，自噬在骨骼系统的生长和稳态维持方面的作用得到日益关注。在骨质疏松症的研究中发现，大鼠接受药物干预后，自噬标志物Beclin-1、LC3、ATGS和成骨标志物Runx-2、BMP-2的表达呈正相关，均显著增加；micro-CT检测发现大鼠脊椎骨骨小梁的数量及厚度、骨密度、骨量均显著增加，这表明自噬水平的增加与骨质疏松的改善有关[2]。由于自噬在细胞应激和环境适应中发挥着重要作用，作为应激因素的糖皮质激素可诱导细胞自噬反应已得到证实。且大多数研究表明，通过激活、促进自噬，可以调控GIOP过程中骨形成相关细胞的功能状态，提高成骨能力，保护骨骼。然而，针对骨质疏松症和糖皮质激素性骨质疏松症，自噬发生的靶细胞和表型存在差异。杨钰粒等[6]认为，在OP中，自噬异常参与的靶细胞主要集中在破骨细胞和少量成骨细胞，其表型以骨密度减少，骨组织紊乱为主，临床以骨脆性增强，易折断为主要表现；而在GIOP中，自噬靶细胞主要为成骨细胞和少量破骨细胞，表现为成骨细胞数量减少，早熟成骨细胞凋亡，临床以骨质疏松、骨折、骨坏死为主要表现。

3 自噬在GIOP中的作用机制

3.1 GIOP与骨髓间充质干细胞自噬

骨发育过程中的成骨前体细胞主要来源于骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)。BMSCs的异常主要表现为分化能力和数量的变化。正常范围的GC可促进BMSCs增殖，并向成骨或成脂分化，而高浓度GC则促进BMSCs成脂分化，同时减少核转录因子的表达以及BMSCs的增殖从而抑制骨生成[7]。Komori[8]研究表明，自噬对糖皮质激素诱导的骨细胞凋亡具有保护作用，但在过量的糖皮质激素时，自噬过程导致BMSCs成骨分化能力受限，并诱导细胞凋亡、抑制Wnt信号通路和调节成骨细胞和骨细胞中microRNA的表达来抑制骨形成。王龙[9]研究发现，无论是GIOP大鼠的BMSCs还是体外地塞米松直接处理的BMSCs，在糖皮质激素诱导下均发生自噬，自噬能够维持BMSCs增殖活力并抑制高浓度GC造成的凋亡。万永鲜[10]研究表明，骨质疏松BMSCs表现出更明显的衰老表型，且成骨分化能力和自噬水平较弱；促进自噬可增强骨质疏松BMSCs的成骨分化，从而提高其成骨能力。因此，在糖皮质激素刺激的应激环境下，一定程度的自噬可从BMSCs增殖和分化能力方面扮演保护细胞的角色。

3.2 GIOP与成骨细胞、骨细胞自噬

成骨细胞(osteoblast，OB)由BMSCs分化而来。在骨形成过程中，OB陷于骨基质则分化为骨细胞，OB和骨细胞在骨组织合成过程中起主要作用。研究表明，长期大剂量应用GC能诱导自噬发生，此时体内外自噬标志物表达增加，骨细胞内自噬空泡积累及自体吞噬增加[11]。随着研究逐渐深入，发现GC对骨细胞的影响多是在对成骨细胞或破骨细胞的影响基础上。针对OB，发现临床中应用不同剂量的GC会有不同程度的疗效及不良反应，而 GC影响成骨细胞活力也呈时间和剂量依赖性。低剂量地塞米松(<10-8mol/L)可使成骨细胞自噬水平与细胞活力显著增加，凋亡减少，高剂量(>10-6mol/L)可加速细胞凋亡[12]。小鼠成骨细胞系MC3T3在地塞米松诱导下发生的自噬活动，48 h达到高峰，随后下降[13]。地塞米松干预大鼠4周，成骨细胞自噬活性增强，骨形成无降低，大鼠骨量也无明显丢失；干预9～12周，不同剂量地塞米松组的成骨细胞自噬活性降低，骨形成及BMD也随之下降[14]。由此可见，长时期、高剂量的GC应用可通过降低成骨细胞自噬水平，导致GIOP的发生。对于自噬水平表现出和GC作用一致的时间和剂量依赖性，韩愚弟[13]、瞿功玲等[15]均认为其原因可能是，过高浓度和长时间的GC作用过度激活自噬，自噬相关蛋白质和底物消耗过快，合成速度变低，自噬水平下降，细胞凋亡。这提示GC作用下自噬对成骨细胞增殖起保护作用，随着GC浓度的增高自噬水平明显增加但相对不足，不能抵抗高浓度GC对细胞增殖的抑制作用[16]。因此，一定水平上提高自噬水平有助于促进成骨细胞增殖，而只有适度的自噬下，才能使蛋白质分解合成有序，延缓细胞凋亡。

3.3 GIOP与破骨细胞自噬

破骨细胞(osteoclast，OC)主要行使骨吸收的功能，和OB共同维持骨稳态的平衡。Han等[17]研究表明，过量GC会减少破骨细胞凋亡，导致破骨细胞数量增加，寿命延长，破骨细胞生成增多，形成骨质疏松症。随着糖皮质激素剂量的增加，破骨细胞在0.1 μmol/L时生成增加，1 μmol/L时出现峰值，10 μmol/L时相应减少，即糖皮质激素对破骨细胞的形成和功能具有剂量依赖性的正效应；其发生的主要机制是GC通过促进自噬诱导破骨细胞的产生[18]。Fu等[19]研究表明，Dex治疗组小鼠骨小梁微结构恶化，破骨细胞数量和分布面积增加(P<0.01)；同时，Dex给药后小鼠破骨细胞中的自噬增加，表现为自噬体数量增加和自噬相关蛋白水平上调。在骨质疏松症的研究中，大多结论与在GIOP中一致，降低自噬能够抑制破骨细胞分化和功能，保护骨骼。然而亦有不同结论，认为下调自噬可以抑制破骨细胞的分化[20]。其原因可能是，在破骨细胞的分化过程中，自噬起着正向调控作用，而在成熟的破骨细胞中，自噬则主要发挥维持稳态的作用[6]。这种看似矛盾的结论，可能与OB和OC所处的状态和阶段有关。

4 GIOP中自噬发生的相关信号通路

mTOR信号通路是针对破骨细胞负性调控自噬水平的主要信号通路。其中，PI3K/Akt/mTOR信号通路介导了在糖皮质激素诱导的骨丢失中破骨细胞自噬的增强[19]。GC可以通过MAPK/ERK信号通路激活自噬，MAPK/ERK是自噬的正性调节因子，抑制这一途径可以在基础条件下减少自噬。研究提示，地塞米松预处理降低骨细胞对氧化应激诱导细胞死亡的敏感性，抑制MAPK/ERK可使自噬体的形成减弱，导致骨细胞死亡[21]。说明水平适中的糖皮质激素引起骨细胞自噬是一种新的细胞保护功能，以防止氧化应激和其他损伤引起的细胞死亡。同时提示在某些条件下氧化应激可诱导细胞发生自噬。研究表明，在小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞中，GC通过激活细胞自噬和内质网应激(ERS)，促进大量活性氧物质(ROS)产生，进而促进细胞凋亡[22]。

GC激活OPG/RANKL/RANK通路可促进骨的吸收导致骨量减少，骨强度降低[23]。研究发现敲除自噬相关蛋白Atg7，小鼠在发育期和成年期均表现出骨量减少，骨小梁体积降低。这种表型归因于成骨细胞TNFSFII/RANKL增加，OPG减少，破骨细胞活化；而Atg7缺乏以依赖于DDIT3/CHOP和MAPK8/JNK1-SMAD1/5/8的方式阻碍成骨细胞矿化并促进部分细胞凋亡，重建Atg7可改善内质网应激并恢复骨骼平衡[24]。可见，GIOP与成骨细胞自噬缺陷相关，是通过OPG/RANKL/RANK通路介导的，而成骨细胞中Atg7缺乏引发ERS应激。有文献报道，糖皮质激素诱导的内质网应激激活了IRE1α/XBP-1 s信号转导和诱导自噬，进而对内皮细胞的存活和增殖起到保护作用，避免了糖皮质激素对细胞的进一步损伤[25]；而在骨平衡中，激素诱导的细胞自噬和凋亡与内质网应激及股骨头缺血有密切联系[26]。

5 讨论与展望

在GIOP的形成发展过程中，具有治疗和致病双重作用的糖皮质激素，同时作为应激因素，可调控细胞自噬。自噬在GIOP发生发展过程中所起到的作用至今仍未非常明确。其原因有三：①与GC的剂量相关。上述多项研究均表明，GC对细胞数量和功能的影响具有剂量依赖性。低剂量、短时期的GC应用常使细胞自噬增强，促进细胞增殖及功能的发挥；反之，细胞自噬能力降低，细胞增殖及功能受到抑制。可见，自噬的发生对GC同样具有剂量依赖性。②GIOP由多细胞参与，各细胞功能不同。在低剂量、短时期的GC应用时，GC激活自噬，此时BMSCs的成骨分化能力增强，OB和骨细胞数量增多、功能增强，而同时，GC通过促进自噬诱导了OC的产生。OC与BMSCs、OB、骨细胞的功能产生拮抗，因此，自噬作用产生争议，与OB和OC所处的状态和阶段有关。③自噬与凋亡的关系。很多自噬或凋亡相关蛋白起着双开关的作用，使得自噬与凋亡高度关联，共同决定细胞命运。因此二者关系主要表现为两种，一是自噬与凋亡合作，都造成细胞死亡；二是自噬可通过更新细胞内物质抑制凋亡[27]。在研究自噬与GIOP中的作用机制，势必应同时考虑凋亡的作用。另外，有研究提出自噬的发生与年龄、性别因素相关[28]，此相关性同样发生于GIOP中，这也是考虑自噬作用的重要影响因素。

综上所述，基于自噬在GIOP中所发挥的积极作用，调控自噬可能是GIOP临床治疗的一个新靶点。然而自噬水平的调控仍需进一步探索研究。首先，自噬在调节骨细胞内稳态时，其有效性存在于一个狭窄而微妙的稳态范围内。要利用自噬开展GIOP的治疗研究，需要进一步精确调控在GC和治疗药物作用下，BMSCs、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞的自噬水平，其中尤以成骨细胞和破骨细胞最为关键。其次，治疗药物的研究。抗GIOP一线药物联合自噬激活剂/抑制剂，或联合基于自噬的调控剂，如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等抗凋亡蛋白，或caspase-3、caspase-9、Bax等凋亡相关蛋白的作用效果与时机需进一步明确。近年来，中医药防治GIOP取得了较大进展，明确自噬与中药、方剂的关系及作用机制能够为GIOP的治疗提供新方向。