非编码RNA在骨质疏松症预测和防治中的作用研究进展

马明领 董辉 杨斌 王永祥*

1.大连医科大学研究生院，辽宁 大连 116044

2.扬州大学临床医学院，江苏省苏北人民医院骨科，江苏 扬州 225001

骨质疏松症(osteoporosis，OP)的主要特点为骨组织微结构遭到破坏，骨小梁数量减少，骨脆性增加，在轻微外力作用下即可发生骨折[1]。骨质疏松症分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症，其中女性绝经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症在原发性骨质疏松症中较为多见。继发性骨质疏松症指继发于某些其他疾病或服用某些药物后引发的OP，比如糖尿病、甲亢、肾病等全身代谢性疾病或大量服用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物[2-3]。非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是指不能编码蛋白质、但却具有极其重要的生物学功能的一类RNA。除转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)外，非编码RNA主要还包括：相对分子量较小的RNA如微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、环状RNA(circRNA)、核内小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等以及相对分子量较大的长链非编码RNA(lncRNA)[4-5]。这些非编码RNA的功能及表达水平的失调，可引起各种疾病，其中包括骨质疏松症[6]。近年来，越来越多的研究[7]表明非编码RNA作为表观遗传调节剂，能够在基因层面对OP的发生发展起到调控作用。本文将主要对circRNA、lncRNA、miRNA和siRNA在OP诊断和防治中的应用特点进行综述。

1 circRNAs与骨质疏松症

circRNA是非编码RNA的一种，是新型共价闭合的环状分子，数量较多且能够在血液等体液中稳定存在，不易被核糖核酸酶(RNase)降解，在组织表达中特异性高[8]；对细胞生长和细胞信号转导有着重要作用[9]。研究[10]证实circRNA可作为OP诊断的生物标志物和治疗靶点，在OP预测和防治中发挥着重要作用。

1.1 circRNAs与骨形成

研究[11]发现 TNF-α通过抑制破骨细胞(osteoclast，OC)源性外泌体中的circRNA-circHmbox1的表达，进而抑制骨形成，circRNA-circHmbox1能够靶向结合miRNA-1247-5P并抑制其表达，促进成骨细胞(osteoblast，OB)分化，促进骨形成。Wang等[12]通过体外细胞和体内研究发现在糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)中，hsa-circRNA-0006393出现低表达，证实hsa-circRNA-0006393作为miR-145-5P的海绵，可通过直接靶向抑制miR-145-5P和上调FOX01的表达促进成骨细胞分化。circFOXP1在OP患者中的表达水平与非OP患者相比显著降低，circFOXP1被证明可作为miR-33a-5P的海绵，靶向结合miR-33a-5P并抑制miR-33a-5P的表达，从而增强人脂肪源性间充质干细胞(hASCs)的成骨分化能力[13]。Lin等[14]研究发现 circ-SLC8A1在卵巢切除(OVX)小鼠中高表达，沉默circ-SLC8A1可增强miR-516b-5P的表达，circ-SLC8A1在胞质中发挥竞争性内源性RNA(ceRNAs)的作用，通过阻断miR-516b-5P对AKAP2表达的抑制作用，以此抑制骨形成。另外Wen等[15]发现circRNA-0076906可诱导hMSCs的成骨分化作用，circRNA-0076906可作为miR-1305的海绵，与miR-1305靶向结合并抑制miR-1305的表达，而miR-1305又能够负向调控靶基因Osteoglycin(OGN)的表达，研究证实circRNA-0076906可通过miR-1305/OGN通路促进hMSCs的成骨分化，从而延缓OP的进展。

1.2 circRNAs与骨吸收

核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和集落刺激因子1(CSF1)在破骨细胞的分化成熟中发挥着关键作用[16-17]。Chen等[18]发现在RANKL+CSF1处理的骨髓巨噬细胞(BMM)中，circRNA-2831表达上调，体内外circRNA-2831基因敲除后发现，BMM破骨细胞分化以及OVX小鼠骨吸收受到显著抑制，研究表明circRNA-2831可作为ceRNA与miR-195a靶向结合，从而抑制miR-195a的表达，circRNA-2831/miR-195a/CSF1共同形成ceRNA网络，调控OC分化和骨吸收。另外Liu等[19]研究发现circRNA-0007059和骨形态发生蛋白2(BMP2)在绝经后骨质疏松症(PMOP)中表达下调，进一步研究发现circRNA-0007059作为miR-378的海绵，能够靶向作用于miR-378；且发现BMP2的3′-UTR有miR-378的结合靶点，miR-378与BMP2靶向结合并对其发挥负性调控作用。circRNA对骨质疏松的调控作用主要是其能够作为miRNA的海绵，通过与miRNA靶向结合进而调控miRNA的表达。同时circRNA能够作为ceRNA,与miRNA、mRNA共同形成circRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，从而使其能够从基因层面调控骨形成与骨吸收。

2 lncRNAs与骨质疏松症

lncRNA由大于200个核苷酸组成，其在结构上类似mRNA，但不具有编码蛋白质的生物学功能[20]。lncRNA自2002年首次被发现以来[21]，虽最初被认为只是转录后的“副产物”，不具有生物学功能，甚至被认为是转录中的“噪音”，但近年研究证实lncRNA在表观遗传调控、细胞分化以及细胞周期等生命活动中发挥着重要作用[22]。lncRNA通过涉及miRNAs、mRNAs和蛋白质的不同机制来执行其功能[23-24]，在基因转录以及在转录后调节靶基因表达水平上，参与包括OP在内的机体疾病的发生与发展[25-26]。

2.1 lncRNAs与骨形成

研究[27]发现lncRNA CCAT1能够与miR-34a-5P竞争性结合，阻止其靶基因MURF2的降解，从而抑制去卵巢大鼠OB的分化和增殖，因此研究提出可通过沉默lncRNA CCAT1防治骨质疏松症。Yang等[28]发现lncRNA MEG3对骨代谢具有重要的调控作用，lncRNA MEG3能够特异性地与miR-214结合，下调miR-214的表达，从而使TXNIP mRNA 表达上调，抑制OP大鼠成骨细胞分化、增殖能力，对骨质疏松症具有正性调控作用。Che等[29]对OP小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)检测发现lncRNA HCG18表达增加，miR-30a-5P表达降低；而在BMSCs向OB分化过程中，HCG18表达显著降低，miR-30a-5P表达显著提高，HCG18基因敲除则可进一步促进miR-30a-5p表达，研究证实HCG18通过miR-30a-5p/NOTCH1轴抑制BMSCs成骨分化作用,进而导致骨质疏松，可见lncRNA HCG18可能是BMSCs成骨分化的调节因子。Yin等[30]研究表明lncRNA AK039312和AK079370均可与miR-199B-5P靶向结合，增强GSK-3β mRNA表达，进而抑制Wnt/β-catenin通路，最终抑制OB分化和骨形成；miR-199B-5P作为OB分化的调节因子已被证实[31-32]，GSK-3β作为Wnt/β-catenin通路抑制剂，可使β-catenin磷酸化从而使其降解[33]。

2.2 lncRNAs与骨吸收

lncRNA参与成骨细胞分化、骨骼发育和骨骼疾病发生等过程[34-36]，然而关于lncRNA在体内破骨细胞形成过程中的作用信息有限。Liu等[37]通过RNA测序(RNA-seq)鉴定lncRNA在破骨细胞分化过程中的表达谱，发现1 117个lncRNA在OC中存在差异表达，其中表达上调的lncRNA 有699个，其余418个lncRNA表达下调，并发现lncRNA ENSG00 000 257 764.2-miR-106a-5p-TIMP2构成的ceRNA网络可能对于OC的分化成熟作用显著。Li等[38]研究证实LncRNA H19能够与miR-29a-3P靶向结合，促进破骨细胞炎症因子TNF-α、IL-1、IL-10的表达，引起破骨细胞的增殖和凋亡，能够参与OP的发生发展。Du等[39]研究发现在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL诱导的CD14+外周血单核细胞(PBMCs)向OC分化过程中，lncRNA TUG1表达显著上调，且沉默TUG1表达发现抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性细胞数量减少、TRAP蛋白水平下降，而MafB蛋白水平增加，研究证实lncRNA TUG1在破骨细胞中过表达，并可与MafB靶向结合，对破骨细胞的成熟分化具有正向调节作用。另有研究发现lncRNA Nron对OC的形成具有调控作用，Nron的表达与破骨细胞的形成呈负相关，免疫荧光染色和Western blot结果证实，活化T细胞核因子1(NFATc1)蛋白可被Nron阻止进入破骨细胞核，影响OC的分化，抑制OC的形成[40]。lncRNA在真核生物的多种组织中广泛表达，其能够调节多种生理和病理过程,可通过检测血液或其他可获取组织中的lncRNA表达水平的变化为骨质疏松症的早期诊断、治疗及预后情况的评估提供一定的参考。

3 miRNAs与骨质疏松症

miRNA是一种分子量较小的单链非编码RNA，约由20～25个核苷酸组成。miRNA作为表观遗传调控因子，能够与mRNA的3’-UTR靶向结合，具有选择性的抑制、切割、降解内源性mRNA的作用，最终抑制靶基因的翻译，改变其生物活性[41-42]。miRNA存在于各种生物中，可在基因层面调控细胞增殖、分化、凋亡等过程[43]。miRNA可以对机体中超过50 %的蛋白编码基因进行调控[44]。

3.1 miRNAs与骨形成

最新一项研究[45]对120名绝经后女性进行基因检测后发现OP组miR-206表达水平显著低于正常对照组，并且miR-206在OP患者中的表达水平与骨密度(bone mineral density BMD)呈正相关，miR-206与组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)靶向结合调控OB的增殖、凋亡，影响骨形成，参与骨质疏松症的发生发展。Li等[46]在小鼠原代OB中发现miR-2861，它被认为是一种新的miRNA，能够靶向抑制HDAC5表达，促进骨形成；抑制miR-2861的表达后BMP2的表达随之下降，而过表达miR-2861则会增强BMP2诱导的骨形成过程，可见miR-2861在骨形成过程中发挥着正向调控作用。Sun等[47]研究发现，miR-103-3p可通过直接靶向抑制m6A甲基转移酶METTL4抑制骨形成，在OVX小鼠中治疗性的抑制miR-103-3P的表达，发现骨形成减少，表明miR-103-3P/METTL14/m6A信号轴能够有效调控骨形成过程。Wu等[48]发现miR-199a-3P通过与Kdm3a靶向结合并负向调控Kdm3a的表达，抑制成骨细胞分化，而Kdm3a能够促进Erk2和Klf2 mRNA的表达，促进成骨细胞分化。Klf2能够增强人骨髓基质细胞的自我更新能力，促进组织器官再生，Klf2通过与Runx2靶向结合在成骨细胞分化中发挥生理功能，当抑制Klf2的表达会对成骨细胞和破骨细胞产生相反的效应，前者分化能力减弱，后者分化能力增强[49-51]。

3.2 miRNAs与骨吸收

研究发现miRNAs可通过促进或抑制破骨细胞的分化来调控骨质疏松。Shen等[52]研究发现miR-128水平与OVX小鼠/PMOP患者骨标本和OVX小鼠原代BMMs中NFATc1水平升高呈正相关，而去乙酰化酶1 (SIRT1)是miR-128在OC分化过程中转录后水平的直接靶点，SIRT1水平的升高可抑制TNF-α和IL-1的表达，从而降低NF-κB的活性，在BMMs中过表达或抑制miR-128发现OC的生成显著增加或减少，OC中miR-128的缺失能够显著抑制OVX触发的OC生成，并对小鼠骨丢失起到保护作用，研究揭示了由miR-128/SIRT1/NF-κB信号轴介导的OC发生的关键机制，为PMOP的诊断和治疗提供了可能的途径。研究表明在OC介导的骨吸收过程中，RANKL、骨保护素(OPG)和CXCL12发挥着重要调控作用[53-54]。Lian等[55]发现 miR-29a通过调节RANKL和趋化因子CXCL12，抑制OC形成，miR-29a通过与RANKL靶向结合，抑制成骨细胞RANKL的分泌，从而有助于阻止OP的进展。另外Mizoguchi等[56]发现在RANKL刺激下，BMM的miR-31表达显著增强，当抑制miR-31表达时，RANKL诱导的OC形成和骨吸收作用也受到抑制，研究发现miR-31主要是通过靶向结合RhoA并抑制其表达从而调控OC分化，进而调控骨吸收。miRNA作为表观遗传调控因子主要通过调控下游mRNA的表达进而调控成骨细胞介导的骨形成或破骨细胞介导的骨吸收，可针对miRNA的作用通路、miRNA的结合靶点或者对miRNA本身表达水平进行调控来阻止骨质疏松症的进展。

4 siRNAs与骨质疏松症

siRNA是由21～25个核苷酸组成的双链RNA分子[57]，是由进入细胞后的双链RNA(dsRNA)被RNaseⅢ家族中的Dicer切割形成[58]。目前siRNA主要通过RNA干扰技术(RNAi)应用于疾病的防治。RNAi 技术的原理主要是利用双链 RNA降解细胞内同源信使RNA(mRNA)，从而阻断特定基因表达[59-60]。siRNA需要与解旋酶、核酸内切酶等形成RNA介导的静默复合物(RISC),且需要被RISC中的解旋酶解开成两条单链，其中一条单链为反义链与同源mRNA特异结合，使mRNA沉默或降解[61]。siRNA所具有的理化特点(带有负电荷、相对分子质量大、不稳定)决定siRNA需要与载体相结合才能被运送至靶细胞，目前siRNA主要与病毒载体或非病毒载体结合, 进行细胞感染或转染，从而对特定基因进行调控[62]。

原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src参与多种细胞功能，有研究证实Src抑制OB分化，降低Src的表达后发现OB分化增强，骨形成能力增加；同时Src也可以通过调节破骨细胞骨架，提高OC分化能力，促进骨吸收[63-67]。Zheng等[68]建立类固醇相关性骨坏死(SAON)兔模型,之后将Src-siRNA、对照siRNA和生理盐水髓内注射到股骨近端，诱导6周后通过显微CT和组织学分析发现，对照组兔的股骨头干骺端出现明显的骨丢失，而注射了Src-siRNA的兔模型发现骨表面侵蚀减少，OC介导的骨吸收减少，证实siRNA敲除Src可减少骨吸收。Sezlev等[69]以阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)为复合材料制备聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米胶囊，将PEI:RANK siRNA复合物装载至PLGA纳米胶囊，并将其转入小鼠巨噬细胞破骨前体细胞系RAW264.7，发现破骨前体细胞中的RANKL mRNA表达降低，并且研究结果显示OC分化受到抑制，分化后的OC破骨活性降低，成熟OC的抗氧化活性明显降低；此研究表明PEI:RANK siRNA复合物包裹在纳米级PLGA胶囊中，有可能作为一种新的替代方法系统性地治疗骨质疏松症。CKIP-1是骨形成的负性调控因子，参与骨质疏松症的发生[70]；Guo等[71]在体外筛选并鉴定了一个在人、恒河猴、大鼠和小鼠中具有高敲除效率的CKIP-1 siRNA序列即kipp-1 siRNA序列，通过实验证实kipp-1 siRNA序列可促进体外跨物种成骨分化，促进健康小鼠骨形成，阻止骨吸收。

5 结语和展望

目前临床对OP缺乏有效的预测和防控手段，针对OP的治疗药物主要是双膦酸盐类、降钙素类、选择性雌激素受体调节剂类(SERMs)、性激素补充剂、甲状旁腺素类似物(PTHa)、氟化物、锶盐、中药和中成药以及近期在国内批准上市的地舒单抗(Denosumab)等药物，目前以上治疗药物尚不能彻底预防和治疗骨质疏松症。非编码RNA如circRNA、lncRNA、miRNA等能够稳定地存在于血液等体液中，获取及检测方便。相信随着研究的更加深入，非编码RNA能够作为OP预测、诊断的生物标志物及治疗的新靶点，在OP的防治中得到有效的应用。