褪黑素介导抗炎、抗氧化、抗骨质疏松作用在椎间盘退变修复中的研究进展

窦新雨 马云龙 刘晓光*

1. 北京大学第三医院骨科,北京 100191

2. 骨与关节精准医学工程研究中心,北京 100191

3. 脊柱疾病研究北京市重点实验室,北京 100191

4. 北京大学第三医院疼痛医学中心，北京 100191

1 椎间盘退变及炎症对椎间盘退变的影响

1.1 椎间盘退变简介

IVD是维系脊柱正常生理活动的重要组织结构，主要包括纤维环(annulus fibrosus，AF)、髓核(nucleus pulposus，NP)和软骨终板(cartilage endplate，CEP)等重要结构。组织学上，IVD细胞及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)代谢平衡共同维持着IVD微环境稳态，遗传、衰老、持续性压力负荷等因素会破坏这种平衡并诱发IDD[1]，后者也是引起下腰痛(low back pain，LBP)的重要影响因素。组织学上，IDD特征表现包括固有细胞数目减少、ECM降解、炎症因子浸润、血管与神经长入等。根据退变情况可将IDD分为早期和晚期，早期IDD无明显临床症状，但IVD内蛋白多糖(proteoglycan，PG)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)及II型胶原蛋白等ECM合成基质减少，I型胶原蛋白及IVD降解相关蛋白酶明显增加，这些分子的变化常与IDD的严重程度呈正相关[2]。随着病程进展与加重，IDD晚期表现为ECM退化严重、NP储水能力丢失及IVD抗应力与拉伸强度降低，随之引发AF破裂和NP疝出，并压迫神经产生症状。

1.2 IDD的病理生理过程

IVD内ECM的过度破坏，尤其是其中II型胶原蛋白、蛋白聚糖的丢失，导致了IDD的发生发展，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin，ADAMTS)为参与ECM降解和IDD的主要的蛋白水解酶，在退行性IVD组织和细胞中高表达(如MMP-1、MMP-3、MMP-13、ADAMTS-5、ADAMTS-7等)。

炎症介质过度产生及炎症相关信号通路活化是IDD发生与进展重要特征之一。IDD组织中常可观察到大量衰老、凋亡的细胞以及多种趋化因子和细胞因子如干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素(interleukin，IL)如IL-1、2、4、6、8、17等过度产生，使得更多的免疫细胞被募集在IVD内并增强炎症反应，进而触发组织退化的级联反应并逐渐加剧IDD[3]。退化IVD因结构完整性丧失为神经支配和血管形成创造了有利条件，而炎症又是加速神经及血管向IVD内生长的促进因素，并可引起LBP[4]。

IL-1β和TNF-α被认为是诱发IDD过程中最重要的炎症因子。研究[5]表明，IL-1β在IDD中表达显著增加，并与IDD严重程度呈正相关。IL-1β不仅能直接抑制ECM合成，还可刺激其他炎症介质的释放和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的合成，导致ECM分解代谢增强。TNF-α可诱导IVD产生多种促炎因子，放大IVD中的炎症反应，如通过使P物质水平增加，进而诱导IL-1β、IL-6、IL-8的表达，或刺激AF细胞产生IL-17[6]。此外，当机械负荷增加时，IVD中TNF-α表达增加，在动态负荷下可穿透健康椎间盘，刺激其它促炎因子的产生，加速IVD的退变[7]。核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)是炎症反应调节中的关键信号通路，作为Rel蛋白家族的重要成员和一种快速诱导转录因子，在IDD炎症反应中发挥重要作用。炎症因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)刺激时，NF-κB迅速转移到细胞核中并调节靶基因的转录激活炎症级联反应。研究[8]发现，靶向敲除NF-κB可显著降低脂多糖诱导的NP细胞凋亡和促炎因子IL-1β与TNF-α的表达；此外，去乙酰化酶SIRT1能够通过抑制NF-κB通路降低IL-1β诱导的炎症反应，并减少IVD细胞凋亡和抑制ECM降解[9]。

氧化应激反应是IDD中的另一病生理过程，随着退变程度的增加，髓核组织中的活性氧(ROS)增加，部分线粒体功能发生障碍。Bai等[10]研究发现ROS可通过焦亡相关蛋白NLRP3/ PYCARD途径诱导NPCs的焦亡，同时促进转录因子核因子(transcription factor nuclear factor, erythroid 2 like 2, Nrf2)和NP细胞的自噬来减弱细胞的焦亡，建立负调控。Tang等[11]也证实过度氧化应激可导致自噬上调，自噬可视为由自噬相关蛋白(autophagy-related proteins，ATG)与Keap1-Nrf2-p62反馈环路激活的抗氧化反应。

而在IDD的过程中，NP细胞内Nrf2的表达进行性下降，在自噬缺陷细胞中，氧化应激反应的有害影响增加[11]。越来越多的研究表明，修复受损的自噬流可以缓解氧化应激的损伤，从而维持细胞内稳态，如Kang等[12]通过使用自噬激活剂姜黄素来恢复自噬通量增强自噬，抑制了过量ROS的产生，修复了线粒体功能障碍，从而减少了NP细胞的凋亡、衰老和ECM的降解。Kang团队[13]利用一种靶向线粒体的抗氧化剂Mitoquinone (MitoQ)，通过PINK1/ Parkin通路来调节NP细胞中线粒体动力学、线粒体自噬通量和Nrf2信号，缓解了线粒体功能障碍和氧化应激，抑制了NP细胞的凋亡，改善IDD。此外，该团队还研究了IDD中的CEP细胞，证明通过上调Parkin和Nrf2可以增强CEP细胞抵御线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡的能力，保护退变的IVD[14]。

此外，IVD发生血管长入也是IDD的特点之一，随着IDD的进展，IVD内血管化程度加重，CEP和AF内层的血管长入通常与组织受损或破坏有关[15]。

2 褪黑素简介

褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色氨酸)是色氨酸代谢产生的一类吲哚类激素，具有亲脂和亲水性，可穿越血脑屏障，其广泛存在于动植物和微生物中。人类褪黑素主要由松果体产生并分泌入体液(血液为主、唾液等)，其他含线粒体的细胞如胃肠道细胞、生殖细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞和免疫细胞等)也可合成。血液中90 %的褪黑素通过肝脏代谢，也可在视网膜、胃肠道、皮肤等的外周器官中快速代谢[16-17]，主要代谢产物为6-羟基褪黑素硫酸盐(6-hMS)，其经尿液排泄，完全清除需1～2 h。生理条件下，褪黑素分泌受光照及昼夜节律的影响，460～480 nm波长的蓝光能够显著抑制其分泌，而分泌高峰在凌晨2～4时[18]。此外，褪黑素的分泌还受药物的影响，非甾体类抗炎药物(布洛芬、吲哚美辛)、抗抑郁药物(氟伏沙明)及高剂量苯二氮卓类镇静药等长期使用均可抑制褪黑素分泌。褪黑素功能广泛，具有显著抗炎及抗氧化作用，在睡眠与昼夜节律调节、神经心血管与免疫系统保护、组织缺血再灌注损伤与细胞衰老以及抗肿瘤等生理和病理学方面的作用均有报道[19]。

3 褪黑素的抗炎和抗氧化作用

褪黑素被认为是免疫细胞功能的调节剂，其抗炎特性及在免疫感受性细胞中调节细胞因子产生已被广泛报道，这表明褪黑素可以改善炎症相关性疾病的临床病程。褪黑素的抗炎和抗氧化作用对于多种退行性疾病具有潜在治疗价值。褪黑素能够诱导Th2淋巴细胞活化并产生IL-4和IL-10等抗炎因子，后者又可抑制Th1淋巴细胞的促炎功能，纠正炎症状态下Th1/Th2的失衡状态从而降低促炎因子水平[20]。褪黑素能够通过上调SIRT-1表达，结合并抑制NF-kB信号通路，减少炎症介质的产生，阻止其向细胞核转移，抑制细胞因子、环氧化酶、诱导型一氧化氮合酶和粘附分子的合成[21]。褪黑素的自分泌作用能够使巨噬细胞转变以抗炎功能为主的M2样表型。

褪黑素是一种天然有效的抗氧化剂，富含电子的芳香系统及由氧甲基和氮乙酰基残基产生的化合物两亲性被认为是其抗氧化功能的分子基础[22]。褪黑素可通过激活多种抗氧化酶活性(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶)和直接中和活性氧自由基来降低氧化应激，抑制具有过氧化作用的多不饱和脂肪酸并稳定生物膜。研究[23]发现，褪黑素还能刺激其他抗氧化剂合成的能力，褪黑素能够诱导γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达，后者是谷胱甘肽合成的限速酶。褪黑素还可以提高线粒体电子传递效率，减少自由基的产生；在严重氧化应激下，其通过酶降解或自由基相互作用，产生许多具有抗氧化作用的代谢物并触发自由基清除级联反应，因此，其在小剂量下也非常有效[22]。

4 褪黑素的抗骨质疏松作用

OP是由多种原因导致的骨密度(bone mineral density, BMD)和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，易发生骨折的全身性骨病。Lou等[24]通过对比绝经与IDD的关系，表明绝经后女性因体内雌激素水平大幅下降，从而导致BMD 迅速下降，同时比同龄男性患有更为严重的IDD。徐浩伟等[25]对OP与LDD相关性的研究进展进行总结，指出BMD与LDD的关系尚不明确，研究其相关性时可能受到许多潜在因素的影响，猜想BMD与LDD在特殊人群中存在相互关系，在临床治疗DDD时，不应忽视OP与IDD可能存在的相互作用。褪黑素可以影响骨代谢，对治疗OP有一定的效果，已有多项研究表明，褪黑素具有促进成骨细胞分化增殖、抑制破骨细胞产生活化的作用，如褪黑素通过增加骨钙素( osteocalcin，OCN) 的表达来促进骨生成[26]，通过抑制NF-κB信号通路从而抑制破骨细胞生成[27]。前文提到的IDD中重要的炎症因子TNF-α通过促进骨质吸收、抑制新骨形成而加速OP进程，因此，褪黑素的抗炎作用也有利于治疗OP。有动物实验[27]表明，用添加褪黑素饮用水喂养雌性小鼠一年后，小鼠血清中的pErk1 /2、pErk5、Runx2和OPG以及RANKL水平增加，提示褪黑素能发挥骨增强作用。王旭东等[28]总结了褪黑素防治OP的研究现状，表明褪黑素在细胞及动物实验层面，具有防治OP的应用潜能。由此可以猜想，褪黑素也可能通过对OP的治疗作用来改善IDD。

5 褪黑素对IVD的保护作用

有关褪黑素在IDD中的调节作用最初由Turgut等[29]于2003年报道，发现褪黑素在体内能够影响退变IVD软骨终板的骨生长和血管分布。该团队后续研究发现，对3天龄Hybro Broiler鸡行手术切除松果体建立褪黑素缺乏模型，养殖至8周龄评估IVD退变情况，结果显示IVD在核磁上呈现典型的退变表现，而且组织学上与IVD退变密切相关的羟基脯氨酸(hydroxyproline，HP)含量也出现明显升高[30]。临床上发现[31]，不同年龄段椎间盘突出患者血清中褪黑素水平与IDD密切相关，IDD发生率呈年龄依赖性增加，而且年龄与褪黑素水平呈负相关、与HP含量呈正相关。该团队[32]进一步在IDD动物模型中观察到外源性褪黑素应用能够引起原本退变间盘相邻椎体骨小梁宽度减小及多核软骨细胞中转化生长因子1表达增高的情况发生逆转，且用药后IVD大体形态也趋于正常。Li等[33]首次报道人类IVD组织和NP细胞中存在褪黑素膜受体MT1和MT2的表达，从2例腰椎间盘突出患者采集的IVD组织及NP细胞中检测到MT1和MT2表达的存在；体外观察发现，褪黑素治疗能够呈剂量依赖性地增强退变IVD中NP细胞的增殖能力，下调细胞周期蛋白D1、增殖细胞核抗原、MMP-3和MMP-9的表达，上调II型胶原α1链和蛋白聚糖水平，且这些作用能被非特异性褪黑素受体拮抗剂Luzindole逆转；进一步研究发现，褪黑素的前述作用是通过与细胞膜受体MT1和MT2结合，降低磷脂酰肌醇3激酶p85调节亚基、磷脂酰肌醇依赖性激酶1和苏氨酸激酶(Akt)的磷酸化实现。

既往研究显示，氧化应激反应、线粒体功能障碍、细胞凋亡与自噬等病生理过程在IDD发展中具有重要作用。He等[34]报道，氧化应激状态下褪黑素能够在体外增强NP细胞的细胞活力，降低氧化分子活性氧自由基和丙二醛的水平，并增强还原分子还原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶活性，这表明褪黑素可能通过改善IDD中的氧化应激状态来恢复内环境平衡，从而发挥IVD修复作用。笔者前期研究[35]发现，体外应用褪黑素能够诱导AF细胞的自噬过程，促进细胞增殖及抑制细胞凋亡；其潜在分子机制是通过抑制miR-106a-5p的表达，降低其与ATG7的3’UTR结合，解除miR-106a-5p对ATG7的抑制，从而增强ATG7的翻译和转录过程。Zhang等[36]研究发现，褪黑素可以提高II型胶原蛋白及PG的表达水平，同时下调MMP-3水平来抑制由IL-1β诱导的NP细胞及ECM重塑；对IDD动物模型进行腹腔注射褪黑素后还可观察到IVD结构完整性得以保护、组织内炎症程度明显减轻。Shen等[37]研究发现，褪黑素能够诱导NP细胞中ECM相关分子表达并抑制人脐静脉内皮细胞的管形成和细胞迁移，可能通过抑制IDD发生过程中的血管长入过程。Zhang等[38]探索了褪黑素对软骨终板细胞凋亡和钙化的影响，结果发现褪黑素以剂量依赖方式降低了细胞凋亡并抑制软骨终板细胞钙化，这可能通过上调SIRT1表达和活性，促进细胞自噬有关。Chen等[39]研究也证实褪黑素一方面能够降低由叔丁基过氧化氢所致NP细胞凋亡的总凋亡率，以剂量依赖性和时间依赖性的激活线粒体自噬及其上游调节因子Parkin的表达，且该过程能被线粒体自噬抑制剂环孢素A部分消除，提示褪黑素对退变IVD细胞保护作用为线粒体自噬依赖性；另一方面，褪黑素还可上调细胞外基质中基质合成分子II型胶原、PG和Sox-9的表达，并抑制基质降解分子MMP-13和ADAMTS-5的表达。Tian等[40]进行的病例对照研究表明，IDD患者血浆褪黑素浓度明显降低，较低的血浆褪黑激素水平与较长的疾病持续时间、较高的疾病严重程度和较高的炎症细胞因子水平相关，血浆褪黑素可作为IDD的诊断标志物。

6 总结与展望

综上所述，IDD是IVD的持续、复杂的退变过程，炎症因子及相关信号通路在该过程中发挥了重要作用，骨质疏松也可能加速此过程。褪黑素具有明确的抗炎及抗氧化作用，可改善炎症病程，清除自由基、降低氧化应激反应，应用于多种疾病的治疗。多项研究表明褪黑素对IVD具有保护作用，对抗骨质疏松也有一定作用。笔者认为，褪黑素在椎间盘退变修复领域的研究空间仍较大，针对褪黑素最佳剂量选择、安全性验证及其参与介导的炎症相关分子机制等方面仍需展开进一步的探索，这可能为IDD的早期药物干预与修复治疗提供新的思路。