LncRNA在骨质疏松中对破骨细胞作用的研究进展

胡芳科 张银光

(天津市天津医院创伤骨科，天津 300201)

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 nt，但不具备编码蛋白质功能的RNA〔1〕。人类基因总数已达到60 554个，其中75%被转录，然而只有2%才可编码蛋白质，其余RNA均不具有编码功能，而lncRNA占到非编码RNA的80%〔2〕，目前GENCODE数据库(V32)中登记的人类lncRNAs可多达17 910种。LncRNA起初被认为是基因组转录的一个“噪音”，不具有生物学功能〔3〕，但自2002年lncRNA的概念首次提出以来〔4〕，越来越多的研究发现lncRNA在基因表达调控方面发挥重要的作用，参与调控众多的生物学进程，如细胞增殖分化、物种进化、胚胎发育、物质代谢及肿瘤发生等〔5，6〕。研究发现，lncRNAs在DNA甲基化和组蛋白修饰等方面也起重要调控作用，在骨形成和骨吸收方面也发挥重要作用〔7〕。

骨质疏松是骨代谢失衡所导致的全身代谢性疾病。骨代谢是一个动态平衡过程，骨吸收大于骨形成，破骨细胞的分化或其功能的改变所导致的骨改建失衡是骨质疏松的重要病理基础〔8〕。破骨细胞由造血干细胞(HSCs)中的单核/巨噬细胞系所分化而来，其在形成、增殖、分化、成熟及凋亡过程中受多种信号通路的影响〔9〕，越来越多的研究显示多种lncRNAs对其中多条信号通路起调控作用〔10〕。Dou等〔11〕通过诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)向破骨细胞分化，采用芯片技术分析破骨细胞分化不同阶段lncRNA的差异表达，结果发现破骨前体细胞阶段有1 643条lncRNA表达上调，2 705条表达下调；破骨细胞成熟阶段有1 896条lncRNA表达上调，2 706条表达下调；破骨细胞激活阶段有2 716条表达上调，3 124条表达下调。Zhou等〔12〕通过绝经后骨质疏松患者外周血单核细胞的研究发现，有309条lncRNAs上调与266条lncRNA下调。越来越多的lncRNAs被发现于破骨细胞的分化增殖中起重要调节作用。

LncRNA在骨质疏松中对于破骨细胞的作用机制是近两年来的研究热点之一。LncRNA可以依赖与靶基因的相对位置及序列特点，采用如通过将转录调控因子募集到邻近的靶基因启动子上的方式等，在转录水平上调控靶基因的表达〔13〕。核转录因子(NF)-κB受体激活剂(RANK)/破骨细胞分化因子(RANKL)/护骨素(OPG)信号通路是影响破骨细胞分化与成熟的经典信号通路〔14〕，多项研究发现lncRNA对于该通路有重要的调节作用〔14～16〕。除此之外，最新研究发现对于Notch信号通路〔17，18〕、活化T-细胞核因子蛋白(NFATc)1通路〔10，19〕、磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路〔20〕、无翅型MMTV整合位点家族成员(WNT)4通路〔21〕及磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)通路〔22〕等也有明确的调节作用。检索文献发现，目前仍缺乏关于lncRNA在骨质疏松中对于破骨细胞作用机制的详尽总结。本文基于上面情况，就lncRNA在骨质疏松中对于破骨细胞的研究进展进行详尽综述，为骨质疏松的进一步研究奠定基础，期待将来发现针对lncRNA的骨质疏松治疗靶点。

1 RNAK/RNAKL信号通路

1.1LncRNA-AK077216促进破骨细胞分化与骨吸收 NFATc1是一种破骨细胞生成转录因子，可经由RANK/RANKL通路激活丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB途径，进而促进破骨细胞的分化〔23〕。NIP45可抑制NFATc1的表达，负向调节破骨细胞的分化和骨吸收〔24〕。Liu等〔15〕通过芯片检测和荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)实验，发现在破骨细胞生成过程中lncRNA-AK077216的表达显著上调。进一步研究发现，lnc-AK077216可抑制活化T细胞核因子胞质相互作用蛋白(NIP)45的表达，进而上调NFATc1的表达，促进RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收〔15〕。Lnc-AK077216作为一种调节破骨细胞形成和功能的lncRNA，同时还可抑制破骨前体细胞凋亡，发挥其促进破骨细胞分化并增强骨吸收的功能〔25〕。

1.2LncRNA-Bmncr抑制破骨细胞分化 先前研究发现lncRNA-Bmncr可促进成骨细胞分化并抑制成脂细胞分化，从而在骨质疏松中起重要作用〔26〕。Chen等〔14〕应用RAW264.7、大鼠骨髓间充质干细胞(BMMs)及小鼠骨质疏松模型的研究发现，在骨质疏松小鼠中lncRNA-Bmncr的表达降低，并可通过抑制RANK/RANKL通路，抑制Atp6v0d2、人抗酒石酸酸性磷酸酶(Acp5)、降钙素受体基因(Ctr)及基质金属蛋白酶(Mmp)9的表达，进而抑制破骨细胞分化及骨吸收，从而起到抑制骨质疏松的作用〔14〕。

1.3LncRNA-NONMMUT037835.2抑制破骨细胞分化 Chang等〔16〕通过共表达网络筛选破骨细胞在各发育时期相关的lncRNAs-信使RNA(mRNAs)，分析结果提示lncRNA-NONMMUT037835.2在破骨细胞分化中起重要作用。在C57Bl/6J小鼠实验中发现，lncRNA-NONMMUT037835.2的上调可抑制破骨细胞分化，而其下调则可促进破骨细胞的形成与融合。研究进一步发现，本作用可能是通过负向调节RANK的表达及抑制NF-κB/MAPK信号通路实现的〔16〕。

1.4LncRNA-SNHG15抑制破骨细胞增殖 Liu等〔27〕在脊柱结核患者中的研究发现，lncRNA-SNHG15的表达水平明显升高。应用RAW264.7细胞系培养实验发现，抑制lncRNA-SNHG15的表达可通过RANK/RANKL信号通路抑制IL-6与TNF-α等炎性因子，抑制破骨细胞增殖，但其在骨质疏松中的作用仍有待进一步研究。

2 Notch信号通路

2.1LncRNA-LINC00311促进破骨细胞分化 Notch信号通路不仅可增加骨质疏松患者成骨细胞的增殖与分化〔28〕，还可影响破骨细胞的增殖与分化〔17〕。δ样配体(DLL)3是目前仅在哺乳动物中鉴定出的位于Notch信号通路中的分歧配体和调节剂，其与成骨诱导有关，还可通过Notch2调节破骨细胞的生成〔29〕，lncRNA-LINC00311正是通过DLL3调节Notch信号通路，从而影响破骨细胞的分化。Wang等〔17〕在大鼠骨质疏松的研究中发现，lncRNA-LINC00311的上调可负向影响DLL3和Notch1，从而调节Notch信号通路，上调Notch2的水平，促进破骨细胞的增殖与分化，抑制破骨细胞的凋亡，最终导致骨质疏松的发生。

2.2LncRNA-DANCR促进破骨细胞生成 LncRNA-DANCR不仅可通过p38/MAPK通路及叉头框转录因子(FOXO)1通路影响成骨细胞分化〔30〕，还可通过Jagged1影响Notch通路，进而影响破骨细胞的形成〔18〕。Jagged1是Notch通路上破骨细胞的重要调节因子，可促进破骨细胞的生成〔31〕，miR-34a-5p也可抑制破骨细胞的生成并可与lncRNA-DANCR特异性作用〔32〕。Zhang等〔18〕在牙根应力研究中发现，阻断lncRNA-DANCR可以下调Jagged1，抑制破骨细胞的生成与骨吸收。进一步研究发现，这一作用与DANCR /miR-34a-5p有关。

3 NFATc1信号通路

3.1LncRNA-MIRG促进破骨细胞生成 LncRNA-MIRG是一种在肢体、肝脏及胎盘中高表达的lncRNA，研究发现其可与miR-1897特异性作用，促进破骨细胞生成与骨吸收〔19〕。Ling等〔19〕通过RAW264.7细胞系培养研究发现，lncRNA-MIRG在破骨细胞生成过程中高表达，且其高表达与破骨细胞生成及吸收有关。进一步研究发现，lncRNA-MIRG可与miR-1897特异性作用，从而上调NFATc1功能，促进破骨细胞的生成与骨吸收。

3.2LncRNA-ENSMUST00000134832和lncRNA-AK082203促破骨细胞分化 窦策〔10〕通过RAW264.7与小鼠骨髓巨噬细胞系BMMs进行破骨细胞分化培养，应用芯片技术检测破骨细胞分化过程中各个阶段的表达情况，构建lncRNA表达分析网络，筛选出lncRNA-ENSMUST00000134832和lncRNA-AK082203，进一步研究发现其与转录因子人活化T细胞核因子(NFAT)1密切关联，可上调NFAT1的表达，进而促进NFATc1的表达，实现了自我放大中的促进作用，是破骨细胞分化过程中正向调控的lncRNA。

3.3LncRNA-Janus激酶(Jak)3促进破骨细胞分化 Lee等〔33〕在痛风患者的研究发现，lncRNA-Jak3及其共表达模式显著上调。通过巨噬细胞系RAW264.7细胞系研究发现，在单水合尿酸钠(MSU)诱导的条件下，lncRNA-Jak3可上调NFATc1的表达，促进破骨细胞分化。进一步机制研究发现，这一过程是通过NFATc1激活组织蛋白酶(Cts)k而实现的〔33〕，但其在骨质疏松中的作用仍有待进一步研究。

4 其他信号通路

4.1LncRNA锌指和BTB结构域蛋白(ZBTB)40-IT1与lncRNA-ZBTB40通过WNT4等调节破骨细胞分化 ZBTB40、ZBTB40-IT1与WNT4基因均位于人1p36染色体上，WNT4可通过非经典WNT通路抑制NF-κB，从而促进间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化以抑制骨质疏松〔34〕。LncRNA-ZBTB40-IT1是ZBTB40内含子的选择性剪接体，与ZBTB40的作用正好相反。Mei等〔21〕通过人骨肉瘤细胞系U2OS与人成骨细胞系hFOB1.19培养，实验结果发现lncRNA-ZBTB40-IT1可调控WNT4通路，影响WNT4、Runt家族相关转录因子(RUNX)2、骨细胞特异性转录因子(OSX)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原α1基因(COL1A1)、OPG与RANKL等因子的表达，从而抑制成骨细胞分化并促进破骨细胞分化，促进骨质疏松的发生〔21〕。ZBTB40可抑制ZBTB40-IT1的表达，与lncRNA-ZBTB40-IT1的作用正相反。本研究发现，在人骨肉瘤细胞U2OS细胞系中，甲状旁腺素可拮抗lncRNA-ZBTB40-IT1的作用并对ZBTB40无明显影响。本研究还发现，单核苷酸多态性(SNP)srs34920465与rs6426749可分别通过招募转录因子UN：FOS与环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(CREB)1的方式调控ZBTB40与ZBTB40-IT1的表达〔21〕。关于lncRNAZBTB40-IT1与lncRNA-ZBTB40在破骨细胞中的作用机制仍有待进一步研究。

4.2LncRNA-牛磺酸上调基因(TUG)1通过PTEN促进破骨细胞的增殖 LncRNA-TUG1在肿瘤及强直性脊柱炎中起重要作用，PTEN通路在破骨细胞凋亡中起重要作用〔35〕，研究发现lncRNA-TUG1可通过PTEN通路促进破骨细胞的增殖并抑制其凋亡〔22〕。Han等〔22〕研究发现，在骨质疏松患者的外周血中lncRNA-TUG1的水平明显升高且与骨质疏松的严重程度有关。通过C57Bl/6J小鼠的研究发现，lncRNA-TUG1的上调可以促进破骨细胞的增殖并抑制凋亡，而其下调正好起相关的作用。进一步研究发现，lncRNA-TUG1的上调伴随着PTEN的下调，作者认为lncRNA-TUG1的促骨质疏松作用是通过PTEN实现的，具体机制有待进一步研究〔22〕。

4.3LncRNA-核富集转录体(NEAT)1促破骨细胞分化 NEAT1是一种主要定位在细胞核内的lncRNA，可参与旁斑的形成。洪宇桁等〔36〕及樊萍等〔37〕通过小鼠骨质疏松模型及RAW264.7细胞培养发现，lncRNA-NEAT1在骨质疏松及破骨分化过程中的表达显著上调，而干扰lncRNA-NEAT1的表达可抑制破骨细胞活性。作者认为lncRNA-NEAT1可促进破骨细胞分化并阻滞成骨细胞分化，从而促进骨质疏松的发生，但其诱导破骨细胞分化的具体作用机制尚未明确，仍有待进一步研究〔36，37〕。

4.4LncRNA-DANCR通过锯齿蛋白(Jagged)1及炎症因子白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α影响破骨细胞生成 从免疫角度上看，骨质疏松可被认为是一种由免疫介导的慢性炎症性疾病。各种原因导致细胞因子的产生和免疫炎症反应的激活，破骨细胞活性增强、骨转换失调，从而导致骨吸收作用增强，产生骨质疏松〔34〕。外周血单核细胞是破骨细胞的前体，可直接参与破骨细胞的生成，还可分泌破骨细胞生成因子IL-6和TNF-α，而IL-6和TNF-α又可作为免疫因子，直接参与骨质疏松的调控〔38〕。LncRNA-DANCR是一种与多种恶性肿瘤有关的lncRNA，Tong等〔39〕研究发现，在绝经后骨质疏松患者中，外周血单核细胞中lncRNA-DANCR的表达显著提高且与IL-6和TNF-α的表达存在相关性，lncRNA-DANCR可通过炎性因子IL-6和TNF-α促进破骨细胞的生成〔9〕。

4.5LncRNA-结直肠肿瘤差异表达基因(CRNDE)通过PI3K/Akt信号通路促进破骨细胞增殖 LncRNA-CRNDE最初发现于结直肠癌中，在多种恶性肿瘤中都有表达〔40〕。Li等〔20〕应用人破骨细胞的研究发现，lncRNA-CRNDE在绝经后骨质疏松患者的破骨细胞中高表达，且高表达的lncRNA-CRNDE可通过PI3K/Akt信号通路促进破骨细胞增殖并抑制其凋亡。研究还发现，雌激素虽可拮抗这一作用，但在雌激素缺乏时本途径依然存在。作者认为对于雌激素缺乏的绝经后骨质疏松患者，lncRNA-CRNDE可能提供新的治疗方法。

4.6LncRNA-肿瘤易感候选基因(CASC)11与绝经后骨质疏松有关 LncRNA-CASC11是一种在多种肿瘤中起作用的lncRNA。Yu等〔41〕研究发现，在绝经后骨质疏松患者血清中lncRNA-CASC11与TNF-α明显升高，升高的lncRNA-CASC11及TNF-α对于绝经后骨质疏松具有诊断意义，且随访还发现其升高与绝经后骨质疏松的治疗进程及复发情况有关。统计发现，绝经后骨质疏松患者经过治疗后，血清lncRNA-CASC11与TNF-α水平都有明显降低。该研究进一步通过人破骨细胞培养实验发现，升高的lncRNA-CASC11与破骨细胞有关，CASC11过表达可导致TNF-α水平的升高，但其具体机制还有待进一步研究〔41〕。

4.7LncRNA-人肺腺癌转移相关转录本1基因(MALAT1)通过miR-124促进破骨细胞分化加速骨修复 在骨损伤的情况下，骨质修复的过程需要破骨细胞的重吸收和内皮祖细胞(EPCs)刺激下的血管再生及骨生成。Cui等〔42〕通过小鼠骨折模型的研究发现，在骨质的修复过程中，lncRNA-MALAT1的水平明显增高。LncRNA-MALAT1可直接与miR-124结合从而负性调节miR-124功能，上调β1整合素(ITGB1)水平，从而增强EPCs诱导的BMMs的迁移及破骨细胞分化，而miR-124的过表达则可反作用于该机制。进一步的研究发现，这一作用是通过lncRNA-MALAT1/miR-124/ITGB1实现的〔42〕。

4.8LncRNA-AK131850通过miR-93-5p促进新生血管生成 Quan等〔43〕应用RAW264.7细胞进行血管再生的研究发现，在破骨细胞的形成过程中，lncRNA-AK131850在新生破骨细胞与成熟破骨细胞中可特异性结合并抑制miR-93-5p，使血管内皮细胞生长因子(VEGF)α分泌增加，进而促进EPCs向新生血管分化，当lncRNA-AK131850抑制时起相反作用。该研究虽然发现在新生破骨细胞与成熟破骨细胞中lncRNA-AK131850可特异性结合并抑制miR-93-5p，但对于破骨细胞分化及凋亡的影响还有待进一步研究。

综上，目前已发现多种lncRNAs通过多条信号通路调节破骨细胞的分化及增殖等，从而影响了骨质疏松的过程。鉴于双膦酸盐类等针对破骨细胞的骨质疏松治疗药物的临床效果及可能抑制骨重建而增加骨脆性的副作用〔44〕，探索及发现新的治疗靶点是将来的研究热点，期待将来发现针对于lncRNA的骨质疏松新治疗靶点。