DA—2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞效果及机制分析

刘志刚　熊敏　曾云　余化龙　何宁

[摘 要] 目的：探讨体外培养条件下DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的效果与机制。方法：取兔股骨， 骨髓腔进行冲洗， 采用全骨髓法分离纯化培养BMSCs，培养至第3代后，分别利用诱导培养液（组A），添加DA-2006的培养液（组B）以及普通培养液（对照组）培养BMSCs，采用噻唑蓝（MTT） 检测3组骨髓基质干细胞增殖能力， 利用荧光定量PCR技术检测骨碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、骨桥蛋白（OPN）等成骨性标志基因的表达情况。结果：经过诱导后，组B细胞具有良好的形态，扩增能力迅速。在生长率方面，诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低。对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（P<0.05）。结论：在含DA-2006的细胞培养液诱导环境下，骨髓基质干细胞的成骨分化强于经典的地塞米松诱导效果，其机制的发挥可能与上调ALP、OC与OPN的表达水平有关。

[关键词] 骨髓基质干细胞；成骨细胞；诱导分化

中图分类号：R681 文献标识码：B 文章编号：2055-5200（2014）02-035-04

前 言

骨髓基质干细胞作为干细胞的一种，具自我更新和多分化潜能，具备成为种子细胞[1-2]的可能，在组织工程发展的热潮中引起科学工作者关注，但围绕骨髓干细胞的相关研究尚处于起步阶段[3-4]。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可以通过跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体RET激活细胞内多巴胺（DA）神经信号，从而促进神经细胞存活和分化过程。aDA-2006是本实验者在实验中筛选、发现的一种易透过细胞膜、无细胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本实验具体分析DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的机制，为骨组织工程的临床应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物：选择南京青龙山的3周龄新西兰大白兔（雄性）。实验试剂与相关仪器：Trizol（美国Invertrogen公司），SYBR Green（日本Toyobo株式会社），反转录试剂盒（日本Toyobo株式会社），0.25% 胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（维森特生物技术有限公司）、细胞孵育箱（赛默飞世尔科技中国有限公司） 、超净工作台（浙江安泰医药有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 脱颈处死大白兔，在75% 酒精中浸泡25-35min后，在兔胫骨结节0.5-1cm处分别抽取骨髓1.5mL，同时加入等体积的DMEM培养液，将液体移至50mL离心管中，1400rpm/min转速离心5-10min，吸去上清及脂肪层，然后在离心管中添加10%FBS的DMEM培养液4 mL，进行颠倒混匀20次，按1×106个细胞/cm2的密度，将细胞接种于10cm细胞培养皿中，置于饱和湿度孵箱（37℃、5%CO2）中培养。经48h细胞培养后，换液50%，去除未贴壁细胞、红细胞等，以后每72h进行一次换液。原代培养9-12d后细胞达80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化后传代[2]。

将第2代细胞分3组进行培养，诱导组A采用诱导培养液[4]（普通培养液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C），诱导组B采用含1?LMDA-2006的普通培养液。对照组采用普通培养液。

1.2.2 检测方法 （1） PCR检测标志基因的表达：取传至第3代BMSCs细胞，吸弃培养液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反复轻微吹打细胞，致细胞脱落，1000rpm/min离心细胞收取，转至1.7mL离心管，加入1mL Trizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混匀，5min室温静置，然后11000rmp离心，时间为15min。将上层的水相转入到1.5mLEP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后放于-20℃冰箱中，过30min后，11000rmp离心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000rmp离心6min。弃上清，静置5min。

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR试剂盒说明书进行。应用Primer Premier 5.0的软件设计、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技术有限公司），其特异性利用融解曲线进行分析验证。

cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β-actin的Ct值作为内参。

反转录结束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按说明书进行荧光定量PCR。

3步法进行Q-PCR扩增，反应条件如下表1。

表1 Q-PCR扩增条件

温度（°C） 时间（S） 循环次数

95 10 1

92 15 45

60 20 45

72 35 45

（2）MTT法测生长率：各组细胞， 经胰酶消化后， 进行计数， 以2.5*103/L接种于24 孔板中， 每一孔添加250?L，3组均处于37℃、5%CO2 条件下进行培养，在检测前，每孔加入4mg/mLMTT25L，继续培养3h， 吸弃培养液， 每孔添加150?L DMSO，振荡10min， 利用酶联免疫检测仪，在490nm 波长进行检测各孔吸光光度值，每日检测3孔， 进行均值计算。

观察不同组别不同时期细胞的形态学，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线，进行生长率的判断与计算。同时观察不同组别的ALP、OC、OPN基因表达情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS软件进行统计处理。所有数据采用x±s显示，组间差异比较，用两样本的均数t 检验，P<0.05为差异具统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学情况

细胞生长的形态学特点如下：具有良好状态，具有梭形形状，且放射状生长，细胞间贴附紧密，70%细胞沿细胞体的长轴排列有序（见图1），细胞具有良好的纯度。通过0.25%胰蛋白酶消化后，传代培养的骨髓基质干细胞生长明显速度增加。但传至20代左右，生长速度会逐渐减慢，细胞内产生颗粒状的堆积物。

图1 传代第3代骨髓基质干细胞（×100）

2.2 生长率情况

该实验分为诱导组A，即诱导培养液组，诱导组B，即含DA-2006的培养液组，对照组，即普通培养液组。通过MTT法，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线（见图2）

3组实验进行一周的细胞培养后，3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低（B组相比于A组，F=0.152，P=0.453），说明组B的诱导能力高于其他两组，但是无明显差异。

图2 骨髓基质干细胞生长曲线图

2.3 成骨分化标志基因表达情况

标志骨髓基质干细胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，这些基因在骨形成中担当着重要作用。通过荧光定量PCR技术，检测这3个标志基因在添加有诱导培养液或者含DA-2006的培养液的条件下的表达变化（见图3）。结果显示对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。

图3 骨髓基质干细胞的成骨分化标志基因表达情况

3 讨论

当前骨髓基质干细胞已经被实验证实其作为载体在细胞治疗和基因治疗方面的价值[6-7]。骨髓基质干细胞相对较容易从骨髓中抽取分离，同时较容易进行体外细胞培养及转染多种外源基因。因此，骨髓基质干细胞相比HSCs在基因治疗方面有更多优势[8-10]，例如HSCs的分离需求大量的骨髓，并且这些细胞是很难大批量体外培养的。

经典的诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的方法包括流式细胞仪分离技术，密度梯度离心法，贴壁筛选法[11-12]。操作较简单的方法为贴壁筛选法，该法筛选的细胞容易成活。在细胞培养过程中，换液次数减少可以保护骨髓基质干细胞的活力。

多巴胺受体可能作为肿瘤干细胞的生物标志物。将人脐带间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子的表达情况，研究指出，脐带间充质干细胞经诱导后可向多巴胺能神经元分化，且分化后的细胞可表达脑源性神经营养因子。而对于诱导骨髓基质干细胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]进行诱导，本实验探讨人工合成的小分子化合物DA-2006的诱导作用及其机制。结果显示3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低，而且诱导组B的密集程度最高，说明含DA-2006的培养液条件下的骨髓基质干细胞的细胞活性比较强，该结果也验证了增值与分化的矛盾统一原理[14-15]。

人类的骨质是由成骨细胞进行骨质的累积和破骨细胞进行骨质的降解相平衡的一个完美的平衡过程。近年来科学家发现ALP、OC、OPN参与了肿瘤形成、细胞增殖和分化、病毒防御等几乎所有的生物学过程，它可能有非常广泛多样的生物功能。本文通过荧光定量PCR实验，检测骨髓基质干细胞在诱导分化后的相关成骨标志基因的表达变化，可以反应其成骨分化水平，骨碱性磷酸酶（LAP）作为成骨细胞表型的标志物之一[16，17]，可反映成骨细胞的活性和功能状况，主要应用于小儿佝偻病早期诊断，骨源性碱性磷酸酶从骨质中分泌，当骨头中钙盐沉淀出现不足时，分泌会增多，骨中钙盐充足则分泌减少。同时相关研究显示，在干细胞诱导分化为成骨细胞时，OPN与OC的表达水平显著上调。本文结果显示，对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A。可能机制在于作为干细胞一种开关的多巴胺能控制成骨中新细胞的形成。如果多巴胺信号被抑制，它们就不能产生新的成骨细胞。

总之，本研究探讨了DA-2006对骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞的作用及分子机制。研究发现在含DA-2006的细胞培养液诱导环境下，骨髓基质干细胞的成骨分化情况较强于经典的地塞米松诱导效果，其机制的发挥可能与上调ALP、OC与OPN的表达水平有关。

参 考 文 献

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