In—Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒

王鹏　刘永兰　雷小英　郭瑞娟　向安　郭晏海

[摘 要] 目的：以血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA为模板，克隆构建HBV X蛋白质的真核表达载体pcDNA-HBx。方法：设计扩增HBV X基因的In-Fusion PCR引物，采用高保真DNA聚合酶分两段扩增HBV X基因序列；采用In-Fusion克隆技术，将两段X基因扩增片段一步克隆入经Hind III和Xba I双酶切的pcDNA3.0真核表达载体，以构建重组真核表达载体pcDNA-HBX；采用Hind III和Xba I双酶切和DNA序列测序筛选鉴定重组载体；pcDNA-HBx 转染HepG2细胞，Western blot检测pcDNA-HBx转染细胞的HBx蛋白质表达。结果：In-Fusion PCR引物分两段扩增获得全长HBx基因序列；In-Fusion获得克隆的pcDNA-HBx经双酶切筛选得到阳性重组质粒，测序分析证实插入序列正确；转染pcDNA-HBX的HepG2细胞，Western blot证实表达HBx蛋白质。结论：以血清HBV DNA为模板克隆HBV X基因，构建了表达HBV HBx蛋白质的真核表达载体，为HBx蛋白质的生物学功能研究提供支持。

[关键词] 乙型肝炎病毒；HBV X基因；基因克隆；表达载体；真核表达

中图分类号：R511 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）02-001-05

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus， HBV）感染是肝癌发生的主要危险因素之一。HBV 编码的分子中与肝癌发生关系最密切的是X蛋白质，HBV X基因编码的X蛋白质（the hepatitis B virus X，HBx）具有多种生物学功能，可与宿主细胞多种蛋白质相互作用，调控宿主细胞基因表达，影响宿主细胞的信号转导、细胞增殖与分化等，其对肝细胞周期与凋亡的影响是HBV致肝癌发生的重要机制之一[1-3]。因此，克隆HBV X基因进行HBx蛋白生物功能研究具有重要意义。

由于血清HBV DNA X基因的特殊结构，使得克隆X基因较为困难。血清HBV病毒颗粒的基因组长约3.2kb，为带有缺口的双链不完全环形结构DNA，称为松弛环状DNA（rcDNA），而X基因位于HBV基因组的1374bp～1838bp，正位于缺口处，而且该区域为高CG区。实验发现：当以血清HBV rcDNA为模板时，用普通PCR一次扩增全长X基因，或用PCR分段扩增后再用PCR扩增拼接的X基因，所获得全长X基因扩增片段经常会出现序列缺失现象[4]。

为克服上述问题，我们采用In-Fusion克隆技术，将分段扩增的X基因片段一次连接克隆入真核表达载体中。In-Fusion克隆技术是利用In-Fusion Enzyme可准确将末端带有15个相互重叠碱基序列的DNA片段融合连接的特性，将一个或多个外源基因片段一次克隆入目的质粒中[5-6]。目的克隆基因片段末端的15 bp重叠碱基序列，是通过特定设计的In-Fusion引物加到扩增片段的末端。In-Fusion HD Cloning Kits 试剂盒可快速准确地将一个或多个外源DNA片段克隆到载体任何位置[7-8]。采用In-Fusion技术，以血清HBV DNA为模板，分段扩增并拼接X基因，将X基因准确地克隆入真核表达载体pcDNA3.0，获得了可表达HBx蛋白质重组真核表达载体。为HBx蛋白质的生物学功能研究提供实验条件。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器

表达载体pcDNA?3.0购自美国Invitrogen生命技术公司；高保真PCR扩增反应液2×Pfu PCR MasterMix、TIANamp病毒DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶DNA 回收试剂盒、感受态Top10购于天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶HindIII和Xba I、In-Fusion HD EcoDryTM Cloning Kit 购自宝生物工程（大连）有限公司；HepG2细胞株购于中国典型培养物保藏中心；鼠抗HBxAg单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体购于圣克鲁斯（Santa Cruz）生物技术公司；NanoDrop2000核酸浓度分析仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）。根据HBV rcDNA X的结构特点，拟分HBX1和HBX2两个片段扩增X基因，然后进行In-Fusion融合连接克隆，所用扩增引物（表1）用http：//bioinfo.clontech.com/infusion/在线软件设计；化学发光底物（BeyoECL Plus Reagent A， B，D3308）。

表1 用于In-Fusion分段拼接克隆的

PCR引物序列

引物 引物序列 HBV基因组位置

P1 GTTTAAACTTAAGCTT CTTACCATGGCTGCTCGG 1368-1385nt

P2 GTGGTCTCCATGCGACGTGCAG 1618-1597nt

P3 TCGCATGGAGACCACCGTGAAC 1604-1625nt

P4 AAACGGGCCCTCTAGA AGGACATGAACATGAGATGATTAGG 1858-1834nt

注：P1下划线部分与pcDNA3.0 HindIII位点5端15个碱基重叠，黑体斜体序列为HindIII识别序列，其余部分为X基因起始区域序列；P2、P3下划线序列为反向互补的15个碱基；P4下划线部分与pcDNA3.0 XbaI位点3端15个碱基重叠，黑体斜体序列为XbaI识别序列，其余部分为X基因终止区域互补序列。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 血清HBV DNA的PCR扩增 采用病毒DNA提取试剂盒分别提取4例HBV感染者血清HBV DNA（HBV病毒血清载量均大于106copies/mL），按图1方案进行PCR扩增。PCR反应液配制：2×Pfu PCR MasterMix 12.5?L，引物P1和P2，或引物P3和P4各1?L（15pmol），HBV DNA样品 3?L，去离子水补至30?L。反应程序：98℃预变性3min；98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，循环30次；最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下切下270bp处的目的片段，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。用NanoDrop2000核酸浓度分析仪测定回收的核酸含量。

图1 PCR分段扩增HBV X基因示意图

注：P1和P2引物扩增HBX1片段，P3和P4引物扩增HBX2片段；两扩增片段间有15个碱基的重叠序列，P1和P4引物的3端15个碱基分别与pcDNA3.0载体HindIII和XbaI双酶切末端15个碱基序列重叠，上述重叠序列用于In-Fusion Enzyme融合连接克隆。虚线为HBV rcDNA残缺的正链部分。

1.2.2 In-Fusion连接、转化及质粒鉴定 每个血清样品获得的PCR片段各10ng与HindIII和XbaI线性化pcDNA3.0载体50ng溶于去离子水，溶液总体积为10?L。将该10?L溶液加到一个 In-Fusion HD EcoDry 反应管中，用移液器将管内In-Fusion HD EcoDry干粉彻底溶解。盖好盖后，反应管于37℃孵育15min，然后50℃加热15min灭活In-Fusion Enzyme，完成融合连接反应（原理见图2），连接反应管置于冰上待转化。取In-Fusion连接反应液3?L与50?L感受态Top10混合，按照In-Fusion操作说明进行重组载体感受态细胞转化，并接种于含氨苄青霉素的LB培养皿中。37℃过夜培养后，挑取单克隆接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养至菌体增殖对数增长期时，保存菌种，其余收菌提取重组质粒，进行HindIII和XbaI双酶切鉴定和DNA测序。

图2 HBx基因扩增片段与酶切pcDNA3.0载体In-Fusion克隆连接示意图

1.2.3 转染细胞 于60mm细胞培养皿中，接种5×105个细胞，培养基为6mL 含10%小牛血清的DMEM，5%CO2培养24h。当细胞融合度达到70%～90%时进行转染操作，主要步骤为：6ug 质粒DNA溶于600?L无血清DMEM，然后加入12?L TurboFect Transfecion Reagent转染试剂，混匀后室温放置20min，将DNA和转染剂混合物全部加到60mm细胞培养皿的培养基中，轻轻摇匀转染培养基。37℃ 5% CO2培养48h，提取细胞总蛋白质。

1.2.4 Western blot分析 收集细胞蛋白质，Bradford测定蛋白质含量。取适量蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶电泳。将凝胶中的蛋白质分子转到硝酸纤维素膜（NC膜）上。转膜完毕后，膜用Western封闭液（P0023B） 4℃封闭过夜。加入稀释（1：500）的鼠抗HBx单克隆抗体（sc-57760，Santa Cruz公司），4℃摇动孵育6h。 以稀释的（1：1000）辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠IgG作为二抗。加入化学发光底物，用化学发光成像仪检测HBx蛋白质条带。Actin抗体（AA128）作为内参。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增

采用In-Fusion PCR引物P1和P2、P3和P4，分别PCR扩增血清HBV DNA样品，每个样品获得266bp和270bp扩增产物（见图3）。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收凝胶中特异PCR产物条带，最后获得30～50ng/?L浓度不等的扩增产物水溶液待用。

图3 PCR产物琼脂糖电泳图谱

注：1和2、3和4、5和6、7和8分别为不同样品X基因的X1和X2片段，X1片段大小为266bp，X2片段大小为270bp；M为分子量marker DL2000。

2.2 In-Fusion连接克隆

4个血清HBV DNA 均获得克隆菌落，重组质粒HindIII和XbaI双酶切鉴定，均可切出长度为491bp插入的X基因的目的片段（见图4）。对重组质粒进行DNA测序，测序结果采用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast与HBV genotype C（LOCUS：AB033556）序列进行比对（见图5），结果4株克隆序列与C基因型HBV X基因序列的同源性均大于97%（480/491=97.76%，481/491=97.96，482/491=98.17%，482/491=98.17%），4株克隆HBV X 基因序列之间均大于98%。证明采用In-Fusion技术方法将血清HBV DNA X基因克隆入pcDNA3.0。

图4 重组质粒pcDNA-HBX双酶切电泳图谱

注：1，3分别为两个未经酶切的pcDNA-HBX质粒；2，4分别为经HindIII和XbaI双酶切的图谱，上方条带为线性pcDNA质粒（5.6kb），下方条带为目的X基因片段，大小为491bp； M1为D2000分子量标准；M2为1kb DNA Ladder分子量标准。

2.3 Western blot 检测

用pcDNA-HBX转染HepG2细胞，提取细胞蛋白质进行Western blot，采用HBx蛋白质特异单克隆抗体进行检查。结果可见相对分子量约为17 kDa的HBx条带出现，而未转染和转染pcDNA空载体的HepG2细胞中未检出HBx蛋白质（见图6）。说明所构建的HBx真核表达载体pcDNA-HBx可在HepG2细胞中表达HBx蛋白质。

图6 Wester blot印迹实验结果

注：1. 用转染HBx表达载体pcDNA-HBX的HepG2细胞提取的蛋白质样品，显示有17kDa的HBx蛋白质表达；2. 用转染pcDNA3.0质粒的HepG2细胞提取的蛋白质样品；3. 用未转染的HepG2细胞提取的蛋白质样品。M：标准分子量蛋白质分子。

3 结论

采用In-Fusion克隆技术分段扩增并克隆带有缺口的HBX基因，可获得保真度高的重组克隆。由于HBV DNA 为松弛环状DNA，其X基因区存在两个缺口，同时该区GC含量较高，尤其是HBX1区域，GC含量高达65%[3]，因此用传统的跨越缺口一步PCR扩增，获得全长X基因序列并不容易，经常发生克隆序列存在缺失或插入现象，造成克隆序列失真，影响表达X蛋白质的功能。In-Fusion克隆技术是基于In-Fusion DNA连接酶可以高效、准确识别并融合两个具有15个碱基重叠序列的DNA片段，避免了仅依靠退火温度，控制DNA片段间拼接而造成的非特异结合。采用分段扩增X基因，可以避免X基因序列缺口对扩增效率和保真度造成的影响，同时采用针对GC含量较高区域的高保真DNA聚合酶PCR反应体系，保证扩增获得的两个X基因片段具有高保真度。扩增获得的两个X基因片段末端间、以及与载体的酶切末端都带有15个特异重叠序列，In-Fusion DNA连接酶可以按照序列，准确地将它们连接起来，获得重组质粒。

与常规PCR引物设计相比，虽然In-Fusion PCR引物设计稍显复杂，但通过专业引物设计软件（http：//bioinfo.clontech.com/infusion/），只需提供载体的多克隆序列、限制性内切酶以及扩增片段的引物序列，即可完成引物设计；另外，In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影响，因此可以采用任何热稳定性DNA聚合酶进行目的片段的扩增[9-11]。

本研究所用的克隆HBV X基因方法，可准确、快速从血清HBV DNA样品中克隆X基因，为HBV感染中X基因研究提供了有效技术手段。为克隆带有缺口基因提供借鉴同时，也为多基因克隆以及基因定点突变提供解决方案。

参 考 文 献

[1] Hongxia Fan， Xiaoli Yan， Yu Zhang， et at. Increased Expression of Gp96 by HBx-Induced NF-κB Activation Feedback Enhances Hepatitis B Virus Production[J].PLoS One， 2013， 8（6）： 655-688.

[2] Julie Lucifora1， Silke Arzberger， David Durantel， et al. ΜLrike Protzer. Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection[J]. Journal of Hepatology， 2011， 55（5）：996-1003.

[3] Gilad Doitsh， Yosef Shaul. A long HBV transcript encoding pX is inef?ciently exported from the nucleus[J]. Virology， 2003， 309（2）：339–349.

[4] 李菡，赵国强. HB x基因真核表达载体的构建及表达[J]. 肝脏，2012，17（5）：332-334.

[5] Sean C. Sleight， Bryan A. Bartley， et al. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering[J]. Nucleic Acids Res，2010，38： 2624 - 2636.

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[9] ?ric Bergeron， César G. Albari?o， et al. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase Function[J]. J. Virol.， Jan 2009， 84（1）： 216 - 226.

[10] GABILLY S T，DREYFUSS B W，KARAMOKO M，et al.Ccs5， a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press，2010，285（39）：29738-29749.

[11] Peihua Jiang， Jesusa Josue， Xia Li， et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（13）：4956-4961.

与常规PCR引物设计相比，虽然In-Fusion PCR引物设计稍显复杂，但通过专业引物设计软件（http：//bioinfo.clontech.com/infusion/），只需提供载体的多克隆序列、限制性内切酶以及扩增片段的引物序列，即可完成引物设计；另外，In-Fusion克隆方法不受插入片段3端是否有突出A的影响，因此可以采用任何热稳定性DNA聚合酶进行目的片段的扩增[9-11]。

本研究所用的克隆HBV X基因方法，可准确、快速从血清HBV DNA样品中克隆X基因，为HBV感染中X基因研究提供了有效技术手段。为克隆带有缺口基因提供借鉴同时，也为多基因克隆以及基因定点突变提供解决方案。

参 考 文 献

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本研究所用的克隆HBV X基因方法，可准确、快速从血清HBV DNA样品中克隆X基因，为HBV感染中X基因研究提供了有效技术手段。为克隆带有缺口基因提供借鉴同时，也为多基因克隆以及基因定点突变提供解决方案。

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[10] GABILLY S T，DREYFUSS B W，KARAMOKO M，et al.Ccs5， a thioredoxin-like protein involved in the assembly of plastid c-type cytochromes.[J].JBC Papers in Press，2010，285（39）：29738-29749.

[11] Peihua Jiang， Jesusa Josue， Xia Li， et al. Major taste loss in carnivorous mammals[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（13）：4956-4961.